专利名称：产生单不饱和甘油酯的方法
技术领域：
本发明涉及甘油酯的技术领域。其涉及通过使用脂肪分解酶制造甘油酯。更具体 而言，本发明涉及通过使用特异性脂肪分解酶来产生单不饱和甘油酯的方法。
背景技术：
已知具有高水平饱和脂肪的饮食会升高血液胆留醇，并增加心血管疾病的风险。 因此，期望在消费品(consumer product)中减少饱和脂肪的量，并增加不饱和脂肪的量。已经发表了一些报道，公开了产生多不饱和脂肪的方法。WO 95/24459 (Norsk Hydro A/S)描述了应用于鱼油的方法，其中将富含多不饱和甘油酯的级分与具有饱和脂肪 酸和单不饱和甘油酯的级分分离。他们并未将级分重新组合以形成甘油三酯，而是继续进 行醇解，直至基本上全部脂肪酸得到酯化。US 6，905，850B2 (Nippon Suisan Kaisha，Ltd) 也涉及鱼油。其描述了产生甘油三酯的方法，所述甘油三酯在2-位具有多不饱和脂肪酸， 并在1-和3-位为具有8、10和12个碳原子的中等链饱和脂肪酸残基。已知多不饱和脂肪酸的减少会增加一些消费品(例如，油炸介质 (fryingmedium))的稳定性，并因此，获得高单不饱和脂肪酸而低饱和和/或多不饱和脂肪 酸的产物是合意的。Malaysian Palm Oil Board描述了基于部分分级的方法，其中他们以棕榈油精 (olein)为起始材料，获得了具有60%单不饱和化合物的终产物(M. R. Ramli, W. L. Siew, K. y Cheah(2008)Properties of High-Oleic Palm OilsDerived by Fractional Crystallization Journal of Food Science 73(3), C140_C145doi :10. 1111/ j. 1750-3841. 2007. 00657. x)。然而，他们宣称获得具有80%单不饱和化合物的终产物仍需 多年研究，因此，对于开发产生富含单不饱和甘油酯的级分的方法仍有强烈需求。
发明内容
在第一个方面，本发明涉及产生甘油酯产物的方法，所述甘油酯与起始的甘油酯 相比富含单不饱和脂肪酸，所述方法包含下述步骤(a)使用对饱和脂肪酸具有选择性的 脂肪分解酶，和/或对甘油酯中的1-位、3-位或两者均具有选择性的脂肪分解酶醇解甘油 三酯；和(b)将富含饱和脂肪酸酯的级分A与富含单不饱和甘油酯的级分B分离。在第二个方面，本发明涉及级分Al和任选的级分A3用于产生生物柴油、表面活性 剂或高纯度等级化学品的用途，其中级分Al和A3均富含饱和脂肪酸酯。在第三个方面，本发明涉及富含单不饱和脂肪酸的甘油酯用于产生消费品和/或 油炸食品，优选可食用的油(edible oil)、食用油(consumer oil)、人造奶油(margarine), 起酥油(shortening)、煎炸油(frying oil)、挂糊并油炸的产品(battered fried product)、烘烤产品(像面包、蛋糕、小甜饼、饼干或零食(snackfood)，例如薯片和薯条)的 用途。在第四个方面，本发明涉及可通过所述方法获得的甘油酯产物，其包含至少70摩尔％、至少75摩尔％、至少80摩尔％、至少85摩尔％、至少90摩尔％、至少95摩尔％、至 少96摩尔％、至少97摩尔％、至少98摩尔％、至少99摩尔％或100摩尔％的单不饱和脂肪酸。在第五个方面，本发明涉及可通过所述方法获得的甘油酯产物，其包含至少70摩 尔％、至少75摩尔％、至少80摩尔％、至少85摩尔％、至少90摩尔％、至少95摩尔％、至 少96摩尔％、至少97摩尔％、至少98摩尔％、至少99摩尔％或100摩尔％的甘油三酯。
图1显示通过缩合(condensation)产生甘油酯产物的方法。图2 显示醇酯的蒸馏富集(distillative enrichment)。术语定义如下定义的术语以大写字母显示，并以字母顺序列出。醇解(ALC0H0LYSIS)是指醇和甘油酯(如油或脂肪)之间的反应。如果该醇是乙 醇，所述醇解也可称为乙醇解，如果使用的是甲醇，则所述醇解也可称为“甲醇解”，等等。生物柴油(BI0DIESEL)定义为长链脂肪酸和C1-C3 —元醇的酯，所述长链脂肪酸 来源于可再生的原料。上述可再生的原料的实例是植物油和动物脂肪。在本发明的上下文 中，长链脂肪酸可定义为链长为10-22个碳原子的脂肪酸链。转化率(CONVERSION)定义为原材料的甘油酯结构中的脂肪酸的摩尔分数，所述 原材料已通过酶催化反应而进行反应。该值可用摩尔来量度。对于甘油酯与乙醇的转酯作 用(transesterification)转化率=FAEE/FAIG，其中FAEE =反应后脂肪酸乙酯的摩尔 数，而FAIG=反应前甘油酯中的脂肪酸摩尔数。对于甘油酯的水解转化率=(FFAss-FFA _)/FAIG，其中FFA_ =反应后游离脂肪酸的摩尔数，FFA_ =反应前原材料中的游离脂 肪酸摩尔数，而FAIG =反应前甘油酯中的脂肪酸摩尔数。结晶(CRYSTALLISATION)用于本文时描述了基于熔点不同的固/液分离方法， 即，在混合物中的一些化合物是固体而一些不是固体的温度下进行。结晶也称为热分级 (thermal fractionation)，胃fT^i吾"SJU^iJM。除臭(DE0D0RISATI0N)基本上是在真空下的蒸汽蒸馏(steamdistillation)。蒸馏(DISTILLATION)是将液体加热至其沸点，冷凝(condense)并以液体形式收 集蒸汽的过程。酯化(ESTERIFICATI0N)是脂肪酸和醇之间的反应，得到酯和水。蒸发(EVAPORATION)是将至少一种组分转化为蒸汽的方法步骤。蒸发包含特定的 形式，如蒸馏和除臭。水解(HYDROLYSIS)是酯和水之间的反应，是酯化的逆反应。脂肪酸馏出物(FATTY ACID DISTILLATE)是在对甘油三酯油进行真空提馏 (vacuum stripping)的过程中由蒸汽洗涤(vapour scrubbing)方法所得的冷凝物，其中真 空提馏用于物理去除游离脂肪酸，以及对甘油三酯油的除臭。除了 FFA或FFA酯之外，所述 脂肪酸馏出物含有不皂化物(unsaponifiable)，例如但不仅限于生育酚(tocopherol)和 甾醇。脂肪原料(FATTY FEED)是含有脂肪酸部分(moiety)的原材料的通名。其可为甘油酯，如单酰基甘油酯(也称作甘油一酯)、甘油二酯、甘油三酯和磷脂，但是，游离脂肪酸 甚至皂(soap)也可以成为脂肪原料的一部分。FFA是游离脂肪酸的标准简称。油或脂肪产物的油精(OLEIN)是通过对该产物在其部分组分固化的温度进行固/ 液分离而得到的低熔点级分。膜分离(MEMBRANE SEPARATION)指用半渗透性膜获得的不同分子物质的液/液分 离的方法。分子蒸馏(MOLE⑶LAR DISTILLATION)是在高度真空中进行的蒸馏，其目的在于尽 可能使用低温以保护热不稳定化合物。提馏(STRIPPING)，当在低于大气压的压力下进行时，也称为真空提馏，是在气体 吹过(blow through)混合物时，使得所述混合物中最具挥发性的组分蒸发的方法。热分级(THERMAL FRACTIONATION)是结晶的另一术语。转酯作用(TRANSESTERIFICATI0N)是具有Rl的甘油酯和具有R2的脂肪酸之间的 反应，由此所述R基团相互交换，得到具有R2的甘油酯和具有Rl的脂肪酸。
具体实施例方式本发明的一个目的是提供高效的方法以供产生高纯度甘油酯产物，其与起始的甘 油酯相比富含单不饱和脂肪酸。目的是进一步产生其他高纯度产物，如脂肪酸酯，其可为饱 和化合物而用于产成生物柴油，或可为不饱和化合物，特别是单不饱和化合物，其可在本发 明方法中重新使用。本发明认为通过所述方法获得的甘油酯、脂肪酸、脂肪酸酯、甘油和醇 产物具有高纯度化学品等级或高纯度食物等级。脂肪分解酶已成功地用作生物催化剂对脂肪酸和其他脂质进行分级。一些脂肪 分解酶排斥(discriminate against)或优选特定底物的能力已被用于在许多类型的反 应(如水解、酯化、相互酯化以及转酯作用)中从天然脂肪和油选择性地富集脂肪酸或其 酯。虽然反应速率取决于反应类型和其他因素(如温度、压力以及反应物的过量和/或缺 乏(d印Ietion))，所述酶的特异性通常保持相同。一个实例可为白地霉(G. candidum)脂肪 酶，其明显优选具有顺-9或顺-9、顺-12键的C18酰基部分，且排斥顺-13-22:1，无论是在 甘油三酯水解还是在脂肪酸与正丁醇的酯化中皆为如此。图1和2仅出于说明目的而包括在本文中，并不应视为以任何方式限制本发明。在 本文中通过应用附图中使用的命名法来对所述附图进行参照。图1显示了油(Fl) +醇(F2) +特异性脂肪分解酶(F3)的特异性醇解(I)。两个级 分通过蒸发(II)分离，其中一个是缺乏(Cbpletion)单不饱和酯(A)的酯，而另一个是富 含单不饱和脂肪酸(B)的甘油酯。级分B，取决于油(Fl)和起始的甘油三酯，可含有不同量 的甘油，甘油一、二和三酯，并通过离心(III)分离以获得缺乏甘油(Bi)的甘油酯级分。该 级分和/或级分B可任性地进行一轮或多轮醇解或水解(IV)，然后是通过蒸发和/或离心 的分离(V)以将更多甘油分离出来，得到更富含单不饱和甘油酯(B》的级分。然后将级分 B2通过添加单不饱和脂肪酸或脂肪酸酯进行缩合(VI)而再酯化。其后的分离(VII)得到 与起始甘油酯相比富含单不饱和脂肪酸的甘油酯产物(BO。也可以分离其他的级分，如醇 (B4)和脂肪酸或脂肪酸酯的馏出物(Β； )。已经考虑到馏出物(Β； )可再循环用于缩合步骤(VI)。在一些实施方案中，本发明涉及产生甘油酯产物的方法，所述甘油酯产物与起始 甘油酯相比富含单不饱和脂肪酸，所述方法包括下述步骤(a)使用对饱和脂肪酸具有选 择性的脂肪分解酶，和/或对甘油酯中的1-位、3-位或两者均具有选择性的脂肪分解酶醇 解甘油三酯；和(b)将富含饱和脂肪酸酯的级分A与富含单不饱和甘油酯的级分B分离。在一个优选实施方案中，用于醇解步骤的酶对饱和脂肪酸具有特异性。一些 对饱和脂肪酸具有特异性的脂肪分解酶的特异性描述于Heldt-Hansen等“A new immobilized positional nonspecific lipase for fat modification andester synthesis" , ACS Symposium Series, Biocatalysis In AgriculturalBiotechnology, vol. 389，1989，pp. 158-172，其显示南极假丝酵母(Candidaantarctica)A 脂肪酶在 使用饱和脂肪酸(月桂酸)醇解三辛酸甘油酯(tricaprylin)时的活性，是使用不饱 和脂肪酸(油酸)的4.3倍。这暗示，在甘油三酯中也优选饱和酸。而在Joshi和 Dhah, Acta Microbiologics Hungarica, vol. 34, pp. 111-114,1987 ψ, M 7^ H (Fusarium oxysporum)脂肪酶选择性水解三种不同底物的饱和脂肪酸棉籽油、落花生油 (ground-nut oil)和来自镰孢属(Fusarium)的真菌油。独立于位置对饱和脂肪酸有选择性的脂肪分解酶可通过下述测试来鉴定，所述测 试使用两种单纯的(homogeneous)甘油三酯-三饱和的(triplesaturated)甘油三酯和三 单不饱和(triple monounsaturated)的甘油三酯，并比较所述酶对这两种底物在相同的 条件下(在单独的容器中或在混合物中)与乙醇的反应速率。它们还可以通过下述测试 来发现，所述测试使用两种乙酯(饱和的/单不饱和的)并与甘油或单纯的甘油三酯(三 个相同的脂肪酸)在真空下反应以去除乙醇，并将这两种乙酯的反应速率相互比较。具体 而言，所述饱和的脂肪酸是棕榈酸，所述单不饱和脂肪酸是油酸，而酶是否是“饱和特异性 (saturation-specific)，，的标准是对于饱和底物有2倍高的活性，其转化率落入0. 05到 0. 50的范围内。将通过这两种测试任一个鉴定为“饱和特异性”的酶用于本发明。在给定油底物中对饱和脂肪酸具有选择性的脂肪分解酶可通过如下来得到，所述 方法是在准备适当的试样后，对所述油进行酶法醇解，并通过GC分析反应产物，如Moreira 等所述(Energy and Fuels, vol. 21, pp3689_3694，2007)。这会允许测定每种乙酯。通过 将该组合物与起始材料中的脂肪酸分布相比较，如果对于饱和脂肪酸的反应速率常数是对 于不饱和脂肪酸的1. 5倍，优选2倍或3倍，而转化率落在0. 05到0. 50的范围内，则可以 鉴定出所述脂肪分解酶。反应速率常数可通过将反应速率(即，每时间单位形成的脂肪酸 酯的量)除以底物中该特定脂肪酸的起始浓度来得到。在一个优选实施方案中，用于醇解步骤的酶是1，3_特异性的。在醇解棕榈油中 使用1，3_特异性的酶会主要得到饱和脂肪酸酯，因为棕榈油几乎绝大多数( 85% ) 在2位携带不饱和脂肪酸。一些1，3-特异性脂肪分解酶的特异性描述于Sien等，JAOCS vol 83，pp923-927(2006)，其使用N0V0Zyme(南极假丝酵母脂肪酶B的固定化形式)以供 区域选择性醇解具有高不饱和脂肪酸含量的三酰基甘油；Rogalski等Chirality，vol. 5， pp. 24-30(1993)阐述了多种脂肪酶，其在实验条件下具有非常严格的1，3_特异性-其 中包括南极假丝酵母B脂肪酶、曼赫根毛霉(lihizomucor miehi)脂肪酶和来自腐质霉属 (Humicola)的脂肪酶；和 Ghazali 等 JAOCS vol 72，pp. 633-639 (1995)，其显示用 1，3-特7异性的脂肪酶对棕榈油精进行转酯作用-其包括了上面提及的那些脂肪酶中的几种。归 类为1，3-特异性的酶的其他实例为萤光假单胞菌O^seudomonas f luorescense)(来自 Amano的脂肪酶AK)和洋葱伯克霍尔德氏菌(BurWiolderia cepacia)(来自Amano的脂肪 酶PS)、皱落假丝酵母(Candida rugosa)(来自Amano的脂肪酶AYS)、米根霉(Rhizopus oryzae)(来自 Amano 的脂肪酶F-AP 15)、沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti)(来 自Amano的脂肪酶G)、爪哇根霉(lihizopus javenicus)(来自Amano的脂肪酶M)、娄地青霉 (Penicillium roquefortii)(来自 Amano 的脂肪酶 R)。对1-位、3-位或两者均具有选择性的脂肪分解酶脂肪分解酶可通过Rogalski等 (Chirality, vol.5, pp 24-30，1993)描述的方法来鉴定。简言之，在滴定装置中对三油酸 甘油酯(triolein)进行酶法水解，并在6%转化率时停止反应。反应产物通过HPLC进行分 析；其可对形成的1，3_和1，2-甘油二酯进行定量。形成的这些甘油二酯的相对量表明所 述酶的位置特异性。当少于5%，优选少于3%或的脱酰基作用发生在sn-2位时，该酶 可称为对1，3-位有选择性。在一些实施方案中，本发明涉及还包含下述步骤(C)的方法使用(i)对饱和脂肪 酸具有选择性的脂肪分解酶和/或对甘油酯中1-位、3-位或两者均具有选择性的脂肪分解 酶，或者(ii)对甘油一酯(monoglyceride)具有选择性的脂肪分解酶对级分B或其亚级分 进行醇解或水解。在步骤(IV)中，级分B进一步由第二个酶步骤加工以降解所述甘油酯 在醇解中，产生醇酯、甘油和残余的甘油酯；或在水解中产生游离脂肪酸、甘油和残余的甘 油酯。对甘油一酯具有特异性的脂肪分解酶可选自从哺乳类组织分离的脂肪酶，例 如，大鼠脂肪细胞的单酰基甘油水解酶、大鼠肝脏微粒体的单酰基甘油脂肪酶、人红细 胞中的单酰基甘油脂肪酶，或选自从细菌菌株分离的脂肪酶，例如，来自假单胞菌属菌 种(I^eudomonas sp. )LP7135的单酰基甘油脂肪酶或来自中度嗜热的芽孢杆菌属菌种 (Bacillus sp.)H-257的单酰基甘油脂肪酶。步骤(IV)的目的是为了形成游离的甘油，并任选地使其分离从而使得步骤(VI) 中的化学计量(stoichiometry)有利于甘油三酯形成。优选在步骤(IV)中使用甘油一酯 特异性脂肪酶，因为这会从级分B或Bl得到甘油的最有效的释放，所述级分B或Bl为主要 是甘油一酯和甘油二酯的混合物。所述之一由Sakiyama等(J. Bioscience and Bioeng. vol 91，pp27-32，2001)例示，其分离并表征了来自假单胞菌属菌种LP7315的脂肪酶，并阐 述其相对二酰基甘油酯，对单酰基甘油酯具有高选择性。对油精、硬脂精(stearin)、棕榈脂 (palmin)和亚油精(Iinolein)的甘油一酯的活性大约相等，且所述酶在65°C是稳定的，所 述温度适于本文所考虑的方法。此外，Imamura和Kitarura从芽孢杆菌属菌种H257分离 了对甘油一酯具有特异性的脂肪酶。这些酶中的任一个在本发明一些实施方案的步骤(IV) 中会是有用的。从醇解或水解(IV)得到的产物混合物在步骤(V)中分离。分离可为液/液分离 (例如，离心)将甘油从其他产物中分离出来，其他产物可继续进行至步骤(VI)。或者，分 离步骤(V)可配置为两个连续的单元操作(two sequential unitoperations)汽/液分 离(如除臭或分子蒸馏)，以分离醇酯或游离脂肪酸(级分B6，其任选地可添加至步骤VIII 供进一步分离成分别富含单不饱和的或饱和的脂肪酸酯的亚级分)，以及液/液分离，以分离甘油，例如离心、倾析(decantation)和膜分离。在一些实施方案中，本发明涉及还包括下述步骤(d)的方法通过离心、倾析或膜 分离的方法从甘油酯级分去除甘油。上述甘油在一些实施方案中可再循环至通过与单不饱 和脂肪酸酯缩合而进行的再酯化步骤(VI)，至得到化学计量(stoimetrically)转化为甘 油三酯所需的程度。在其他的实施方案中，上述甘油可丢弃，或出售用于其他用途。可对级 分B进行甘油去除，在步骤III之后直接进行，或在另外的分离步骤(V)之后进行。在一些实施方案中，分离步骤(III)和/或(V)可在离心之前包括水洗，从而促进 了甘油与甘油酯的分离。此外，膜分离的方法可用于将甘油与甘油酯分离。这由DuW等 (Bioresource technology, vol :98iss :3pp :639-647,2007)描述，其使用膜反应器产生脂 肪酸甲酯并使用碳膜将未反应的甘油酯与甘油产物分离。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中所述甘油三酯包含至少30%、至少 35%、至少40%、至少45%或至少50%的单不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中所述甘油三酯在2-位具有至少 50 %、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %或至少80 %的单不饱和脂肪酸残基。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中甘油三酯的来源是棕榈油；花生 油；大豆油；菜籽油；向日葵油；橄榄油；牛脂(beef tallow)；乳脂；可可脂；猪油；禽类 脂肪或其相应的油精。优选使用棕榈油或优选棕榈油精作为起始材料(棕榈油精是棕榈 油通过热分级得到的富含油精的级分)。获得油精的方法是众所周知的，并描述于，例如 ‘Introduction to Fats and OilTechnology', 0'Brien, Farrr 禾口 Wan 编，AOCS Press, 2000 第 11 章。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中醇解是通过将甘油三酯与低级烷 基醇(优选C1-C3醇，且更优选乙醇)转化来进行的。通过使用乙醇作为用于醇解的醇，会 改进产物的食品效用。期望上述脂肪分解酶的特异性(饱和/不饱和特异性以及1，3-特异性两者)在低 转化程度时会是高的，转化率随着优选底物的消耗与同时较不优选的底物的增加而减少。 因此，优选在低转化率下运行所述反应以获得最高可能的特异性。在本发明一些实施方案 中有利的是，使所有反应产物发挥最佳的效用，甚至在醇解的低转化率下也是如此。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中醇解为脂肪酸酯的转化率低于 5%、低于10%、低于15%、低于20%、低于25%、低于30%、低于35%、低于40%、低于45% 或低于50%。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中醇解为脂肪酸酯的转化率为至少 40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%或至少70%。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中对饱和脂肪酸具有选择性的脂肪 分解酶选自南极假丝酵母脂肪酶A、尖镰孢脂肪酶和它们的变体。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中对1-位、3-位或两者均具有选择 性的脂肪分解酶选自南极假丝酵母B脂肪酶、Chromobacteriumviscosum(槲寄生色素杆 菌)、犬胃脂肪酶、犬胰脂肪酶、腐皮镰孢(Fusariumsolani)角质酶脂肪酶、豚鼠胰脂肪酶、 人胃脂肪酶、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosus)脂肪酶、人胰脂肪酶、脂蛋白脂肪酶、米黑毛霉(Mucor miehei)脂肪酶、铜绿假单胞菌(I^seudomonas aeruginosa)脂肪酶、沙门 柏干酪青霉脂肪酶、萤光假单胞菌脂肪酶、荚壳假单胞菌O^eudomonas glumae)脂肪酶、猪 月夷月旨肪Bi、简青β (Penicillium simplicissimum)月旨肪Si、少牛艮牛艮β (Rhizopusarrhizus) 脂肪酶、兔胃脂肪酶、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)脂肪酶、皱落假丝酵母脂肪酶及 其变体。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中所述甘油酯产物包括长链脂肪酸， 优选具有至少14个、至少16个、至少18个碳原子的长链脂肪酸或其任何组合。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中所述分离方法选自除臭、蒸馏、蒸 发或其任何组合。任何未反应的脂肪酸酯或游离脂肪酸，以及释放的醇可作为挥发性级分 通过除臭、蒸发或蒸馏去除。该挥发性级分还可以分离为醇(任选地用于在步骤(I)中重新 使用)和未反应的游离脂肪酸或脂肪酸酯，其可在步骤(VI)中重新使用。除臭基本上是在 真空下蒸汽蒸馏，并且是本领域众所周知的。除臭器(deodorizer)可在0. 15mbar、225°C以 每小时0. 20%到0. 25%w/w的蒸汽剂量操作。其他操作方式是本领域众所周知的，参见，例 如'Introduction to Fats and Oil Technology', 0'Brien, Farrr 禾口 Wan 编，AOCSPress, 2000 第 13 章。蒸馏和蒸发的方法也是本领域中公知的。油的蒸发设备通常是蒸汽蒸馏设备，称 为除臭器。对于步骤(VIII)，其为在高度真空下使用蒸馏使热损伤(thermal damage)最小 化的实施方案。在本发明一些实施方案中，优选使用具有多个平衡级(equilibrium stage) 的系统以实现良好的分离。其他优选的实施方案包括在0. 001到IOmmHg的压力和140°C 到200°C的温度运行的降膜分子蒸馏器(!filing film Molecular Distillator)或可在约 0. OOl-IOmmHg压力和160到240°C的温度运行的离心分子蒸馏器(Centrifugal Molecular Distillator)(两个方式均在 Batistella 等，Appl. Biotechn. ,vol. 98，1149-1159，2002 中 详细讨论)。可使用直接或间接加热，且可在分批和/或连续操作中运行。还有一个实施方案，以下述方式运行分离步骤II，使得仅棕榈酸乙酯(以及更具 挥发性的组分)与馏出物一起分离，而硬脂酸乙酯、油酸乙酯和亚油酸乙酯与甘油酯一同 保留在浓缩物(concentrate)中。在本发明一些实施方案中，选择压力和温度以实现棕榈 酸乙酯和其他乙酯之间可能的最佳分离。图2包含图1，并除图1外还显示了将级分A进一步分离(VIII)为缺乏单不饱和 脂肪酸的酯(Al)，富含单不饱和脂肪酸的酯m，以及任选的与亚级分Al不同的缺乏单不 饱和脂肪酸的酯(A3)。取决于起始甘油酯中脂肪酸的含量，可产生另外的亚级分。该分离 可通过蒸馏进行，或者通过膜分离或结晶或超临界提取(supercritical extraction)来进 行。在例如棕榈油或棕榈油精的情况下，可设定通过蒸馏的分离以获得几乎纯的棕榈 酸酯。在醇解中形成的脂肪酸酯主要由棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸组成。由于硬脂酸、 油酸和亚油酸的沸点使得其一同分离(参见Batistella等，‘Mathematical development for scaling up of molecular distillators strategyand test with recovering carotenoids from palm oil, 16th Eur. Symp. on Comp. Aided Proc. Eng. and 9th Int. Symp. on Process Systems Eng. , Eds. Marquardtand Pentelides, Elsevier, 2006), ΒΤΚΒ使得一个级分主要为棕榈酸酯而另一个是硬脂酸酯、油酸酯和亚油酸酯的混合物。硬脂酸仅以少量(< 5% )存在于棕榈油精中，且所述硬脂酸酯/油酸酯/亚油酸酯级分构成基本 上富含单不饱和脂肪酸的级分，而所述棕榈酸酯级分可制备为非常纯的棕榈酸酯，使得其 获得额外的价值(premium value)，例如，用于合成表面活性剂或其他化学品。如期望，所述 分离可设定为获得每种脂肪酸酯级分。考虑到富含单不饱和脂肪酸m的酯可再循环至缩合步骤(VI)，或者，该级分 (A2)可与甘油组合以形成富含单不饱和脂肪酸的甘油酯产物(未显示于图中)。而且，在 醇解(IV)的反应步骤过程中，形成可缺乏单不饱和脂肪酸的酯(B6)，这些还可以分离、再 循环并与缺乏单不饱和脂肪酸的酯的第一级分(A) —起进入所述分离步骤(VIII)。或者， 可从外源(F4)提供可用于缩合步骤(VI)的脂肪酸或脂肪酸酯。其可为植物油(例如，向 日葵油、花生油、菜籽油、大豆油、橄榄油，或者来自它们经修饰的富含单不饱和化合物和/ 或贫于(reduced in)多不饱和化合物的变种)的水解物或醇解物。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中将富含饱和脂肪酸酯的级分A进 一步纯化以获得亚级分Al，其与级分A相比富含饱和脂肪酸酯，亚级分A2，其与级分A相 比富含单不饱和脂肪酸酯，和任选的亚级分A3，其与级分A相比富含饱和脂肪酸酯，且与亚 级分Al不同。从甘油酯(II)分离醇酯级分可通过蒸发或除臭来完成。在本发明的一些实 施方案中，步骤(II)和(III)可组合在一个单元操作中，其从甘油酯分离所述醇酯，并进一 步将所述醇酯分离为数种亚级分。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中将所述亚级分A2更进一步纯化以 获得亚级分A2*，其甚至更加富含单不饱和脂肪酸酯。在酯的分离步骤(VIII)中，可设计如 下方法，其中缺乏单不饱和脂肪酸的酯(A)和可富含饱和脂肪酸的酯进一步分离为甚至更 富含饱和脂肪酸酯的级分，和包含不饱和FA-酯的级分。该分离可通过蒸馏或者通过膜分 离、结晶或超临界提取(例如，Crampon，J. Supercritical fluids，vol. 16，11-20，1999)来 进行。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中所述亚级分Al基本上是单一分子 物质(single molecular species)。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中亚级分Al基本上是棕榈酸乙酯； 亚级分A2基本上是油酸乙酯，而亚级分A3基本上是硬脂酸乙酯。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中所述亚级分Al是至少80%、至少 85 %、至少90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %或100 %的棕榈酸乙在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中富含单不饱和甘油酯的级分(B) 和/或由其得到的任何亚级分用富含作为酯或游离脂肪酸存在的单不饱和脂肪酸的组合 物进行再酯化，以产生甘油酯产物，其具有至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少 90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %或100 %的单不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中所述再酯化以酶法进行(the re-esterification is enzymatic)。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中所述用于再酯化的单不饱和脂肪 酸酯从亚级分A2、亚级分k2*或植物油的水解物、馏出物或醇解物获得。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中所述植物油选自向日葵油、花生11油、菜籽油、大豆油、橄榄油或者来自其经修饰的富含单不饱和化合物和/或贫于多不饱和 化合物的变种。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中在甘油酯产物中甘油三酯的含量 为至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、 至少98 %、至少99 %或100 %。在本发明的一些实施方案中，目标是实现高的，但少于100 % 的转化为甘油三酯的转化率。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中所述再酯化还包括去除挥发物 (如释放的醇或未反应的酯和脂肪酸)的步骤。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中去除挥发物的步骤选自蒸发、蒸馏 和除臭。在一些实施方案中，本发明涉及如下方法，其中所述未反应的酯或脂肪酸重新用 于再酯化。在一些实施方案中，本发明涉及使用级分Al和任选的级分A3产生生物柴油、表面 活性剂或高纯度化学品，两个级分均富含饱和脂肪酸酯。举例而言，由本发明某些实施方案 获得的非常纯的乙醇酯生物柴油可用于混入由废物来源产生的生物柴油中，推测后者具有 可变的质量，并需要稳定的混合剂以获得一致的质量。在一些实施方案中，本发明涉及使用富含单不饱和脂肪酸的甘油酯产生消费品和 /或油炸食品，优选为可食用的油、食用油、人造奶油、起酥油、煎炸油、挂糊并油炸的产品、 烘烤产品(如面包、蛋糕、小甜饼、饼干或零食，例如薯片(chips)和薯条(French fries)) 0 考虑到所述甘油酯可为级分B1、B2、B5或其任何组合。富含单不饱和脂肪酸的甘油酯产物 根据本发明的某些实施方案，出于营养目的是更健康的。具体而言，富含单不饱和脂肪酸的 油由于其高稳定性被认为是健康的和作为煎炸油是有用的。在一些实施方案中，本发明涉及可由所述方法获得的甘油酯产物，在所述甘油酯 的总脂肪酸中包含至少70摩尔％、至少75摩尔％、至少80摩尔％、至少85摩尔％、至少90 摩尔％、至少95摩尔％、至少96摩尔％、至少97摩尔％、至少98摩尔％、至少99摩尔％或 100摩尔％的单不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，本发明涉及甘油酯产物，在所述甘油酯的总脂肪酸中还包含 少于5%、少于4%、少于3%、少于2%、少于1 %的饱和脂肪酸。在一些实施方案中，本发明涉及可由所述方法获得的甘油酯产物，包含至少70摩 尔％、至少75摩尔％、至少80摩尔％、至少85摩尔％、至少90摩尔％、至少95摩尔％、至 少96摩尔％、至少97摩尔％、至少98摩尔％、至少99摩尔％或100摩尔％的甘油三酯。实施例通过下述实施例进一步描述本发明，所述实施例不应视为对本发明范围的限制。实施例1-南极假丝酵母脂肪酶A的特异性研究使用具有6KLU活性的酶南极假丝酵母脂肪酶A-Novozym 735-N735 (批号 LDN00026) 0测试底物棕榈硬脂(Palm Stearine) (PS)；大豆油(SBO)；和高油酸油，均购 自 Sigma。Α.脂肪水解1.称量200g油，置于500ml空螺旋盖烧瓶中。
2.将35g水添加入同一烧瓶中，并保持在烤箱温度70°C—小时。3.在 24，OOOrpm 通过高剪切混合(IKA Ultra Turrax T25)处理 90 秒。4.将IOOg乳浊液转移至250ml空螺旋盖烧瓶中。5.添加 600ρρπι(51μ 1)的 Novozym 735。该剂量基于乳液的干基(dry basis)。6.将所述烧瓶置于在200rpm和70°C运行的振荡水浴中。7.在1、2、4、23和24小时后将IOg试样收集至试管中。8.将试管保持在80°C水浴中至少15分钟以使酶失活。9.将试管在3500rpm离心15分钟以将油从水中分离。10.收集油以供游离脂肪酸(FFA)分析B.从油分离FFA(实验室中和方法)1.称量约50g经水解的脂肪。2.持续搅拌加热至70°C。3.添加稍过量4N NaOH以滴定所述油中测量的FFA含量需用于滴定测量的FFA含量的碱剂量使用对于NaOH来说丽为40和对于FFA来 说丽为256(如同所有均为棕榈酸)来计算。举例而言，10% FFA含量计算为需要9. 8% w/w 剂量的 4N NaOH。除了从FFA含量计算出的量之上，再添加1. 25% w/w剂量的4N NaOH。4.继续搅拌15分钟。5.在3500rpm离心15分钟将脂肪酸_皂(fatty acid-soaps)从所述油中分离。6.收集上层的油，并添加10%硫酸钠，然后用膜过滤器过滤。这将协助从油中去 除水和残余的皂。7.分析所述油的FFA和脂肪酸组合物。8.收集皂和下层用于进行皂料(soap stock)的酸化。C.皂料的酸化1.将强酸(HCl)添加入所述皂料直至存在水的分离。此时pH应为约2。2.加热材料，并在80°C到90°C进行搅拌直至可见清楚的分离。3.收集在上层的酸油(acid oil)中的FFA。P.确定脂肪酸概貌(profile)脂肪酸甲酯的制备根据AOCS Ce2_66的方法进行。在可食用的油和脂肪中 的脂肪酸通过毛细管(capillary)GC根据AOCS Cele-91进行，使用具有Supelco SP 2340Fused Silica Capillary Column(熔融二氧化硅毛细柱)的 Agilent 6820Gas Chromatograph ( ^ttBfeiII)。Ε.脂肪酸含量对三种起始材料，对每个反应产物和对每个无FFA的反应产物(将处理的试样皂 化M小时后)使用标准的自动滴定方法测定FFA。由于FFA含量是以摩尔为基础(通过 滴定)测定的，需要代表性的脂肪酸Mw以转换为以质量为基础。为了测定在起始材料中的 FFA，使用在起始材料中最丰富的脂肪酸种类进行换算(对于棕榈硬脂，C16:0 ；对于高油酸 油，C18:l ；而对于大豆油，C18:2)。为了测定在经处理的材料中的FFA，使用棕榈酸的Mw， 因为这是被切割的脂肪酸中最具代表性的脂肪酸。
结果表1-在脂肪水解方法后高油酸油中的％ FFA
权利要求
1.一种产生甘油酯产物的方法，所述甘油酯与起始的甘油酯相比富含单不饱和脂肪 酸，所述方法包含下述步骤(a)使用对饱和脂肪酸具有选择性的脂肪分解酶，和/或对甘油酯中的1-位、3-位或 两者均具有选择性的脂肪分解酶醇解甘油三酯；和(b)将富含饱和脂肪酸酯的级分A与富含单不饱和甘油酯的级分B分离。
2.权利要求1的方法，还包括步骤(c)使用(i)对饱和脂肪酸具有选择性的脂肪分解 酶和/或对甘油酯中1-位、3-位或两者均具有选择性的脂肪分解酶，或者(ii)对甘油一酯 具有选择性的脂肪分解酶对级分B或其亚级分进行醇解或水解。
3.权利要求1-2的方法，还包括步骤(d)通过离心、倾析或膜分离的方法从甘油酯级分 去除甘油。
4.前述任一项权利要求的方法，其中所述甘油三酯包含至少30 %、至少3 5 %、至少 40%、至少45%或至少50%的单不饱和脂肪酸。
5.前述任一项权利要求的方法，其中所述甘油三酯在2-位具有至少50%、至少55%、 至少60%、至少65%、至少70%、至少75%或至少80%的单不饱和脂肪酸残基。
6.前述任一项权利要求的方法，其中所述甘油三酯的来源是棕榈油；花生油；大豆油； 菜籽油；向日葵油；橄榄油；牛脂；乳脂；可可脂；猪油；禽类脂肪或其相应的油精。
7.前述任一项权利要求的方法，其中所述醇解是通过将甘油三酯与低级烷基醇转化来 进行的，所述低级烷基醇优选C1-C3醇，且更优选乙醇。
8.前述任一项权利要求的方法，其中醇解为脂肪酸酯的转化率低于5%、低于10%、低 于15%、低于20%、低于25%、低于30%、低于35%、低于40%、低于45%或低于50%。
9.前述任一项权利要求的方法，其中醇解为脂肪酸酯的转化率为至少40%、至少 45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%或至少70%。
10.前述任一项权利要求的方法，其中对饱和脂肪酸具有选择性的脂肪分解酶选自南 极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶Α、尖镰孢脂肪酶及其变体。
11.前述任一项权利要求的方法，其中对1-位、3-位或两者均具有选择性的脂肪 分解酶选自南极假丝酵母B脂肪酶、Chromobacterium viscosum、犬胃脂肪酶、犬胰脂 肪酶、腐皮镰孢(Fusarium solani)角质酶脂肪酶、豚鼠胰脂肪酶、人胃脂肪酶、疏棉状 腐质霉(Humicola lanuginosus)脂肪酶、人胰脂肪酶、脂蛋白脂肪酶、米黑毛霉(Mucor miehei)脂肪酶、铜绿假单胞菌(I^seudomonas aeruginosa)脂肪酶、沙门柏干酪青霉 (Penicillium camemberti)月旨肪 Si、蛮光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)月旨肪 酶、荚壳假单胞菌O^seudomonas glumae)脂肪酶、猪胰脂肪酶、简青霉(Penicillium simplicissimum)脂肪酶、少根根霉(lihizopus arrhizus)脂肪酶、兔胃脂肪酶、异孢镰孢 (Fusariumheterosporum)脂肪酶、皱落假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶，及它们的变 体。
12.前述任一项权利要求的方法，其中所述甘油酯产物包括长链脂肪酸，优选具有至少 14个、至少16个、至少18个碳原子的脂肪酸或其任意组合。
13.前述任一项权利要求的方法，其中将富含饱和脂肪酸酯的级分A进一步纯化以获 得亚级分Al，其与级分A相比富含饱和脂肪酸酯，亚级分A2，其与级分A相比富含单不饱 和脂肪酸酯，和任选的亚级分A3，其与级分A相比富含饱和脂肪酸酯，且其与亚级分Al不同。
14.前述任一项权利要求的方法，其中将所述亚级分A2更进一步纯化以获得亚级分 A2*，其甚至更加富含单不饱和脂肪酸酯。
15.前述任一项权利要求的方法，其中所述亚级分Al基本上是单一分子物质。
16.前述任一项权利要求的方法，其中亚级分Al基本上是棕榈酸乙酯；亚级分A2基本 上是油酸乙酯，而亚级分A3基本上是硬脂酸乙酯。
17.前述任一项权利要求的方法，其中所述亚级分Al是至少80%、至少85 %、至少 90 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %或100 %的棕榈酸乙酯。
18.前述任一项权利要求的方法，其中富含单不饱和甘油酯的级分(B)和/或由其得到 的任何亚级分用富含作为酯或游离脂肪酸存在的单不饱和脂肪酸的组合物进行再酯化，以 产生甘油酯产物，其具有至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、 至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %或100 %的单不饱和脂肪酸。
19.权利要求18的方法，其中所述再酯化以酶法进行。
20.前述任一项权利要求的方法，其中所述用于再酯化的单不饱和脂肪酸酯从亚级分 A2、亚级分k2*或植物油的馏出物、水解物或醇解物获得。
21.权利要求20的方法，其中所述植物油选自向日葵油、花生油、菜籽油、大豆油、橄榄 油或者来自其经修饰的富含单不饱和化合物和/或贫于多不饱和化合物的变种。
22.前述任一项权利要求的方法，其中在甘油酯产物中甘油三酯的含量为至少70%、 至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至 少 99%或 100%。
23.前述任一项权利要求的方法，其中所述再酯化还包含去除挥发物，如释放的醇或未 反应的酯和脂肪酸的步骤。
24.前述任一项权利要求的方法，其中去除挥发物的步骤选自蒸发、蒸馏和除臭。
25.前述任一项权利要求的方法，其中所述未反应的酯或脂肪酸重新用于再酯化。
26.级分Al和任选的级分A3用于产生生物柴油、表面活性剂或高纯度等级化学品的用 途，所述两个级分均富含饱和脂肪酸酯。
27.富含单不饱和脂肪酸的甘油酯用于产生消费品和/或油炸食品的用途，所述消费 品和/或油炸食品优选为可食用的油、食用油、人造奶油、起酥油、煎炸油、挂糊并油炸的产 品、烘烤产品如面包、蛋糕、小甜饼、饼干或零食，例如薯片和薯条。
28.可由权利要求1-25的方法获得的甘油酯产物，其在所述甘油酯的总脂肪酸中包含 至少70摩尔％、至少75摩尔％、至少80摩尔％、至少85摩尔％、至少90摩尔％、至少95 摩尔％、至少96摩尔％、至少97摩尔％、至少98摩尔％、至少99摩尔％或100摩尔％的单 不饱和脂肪酸。
29.权利要求观的甘油酯产物，其在所述甘油酯的总脂肪酸中还包含少于5%、少于 4%、少于3%、少于2%、少于的饱和脂肪酸。
30.可由权利要求1-25的方法获得的甘油酯产物，其包含至少70摩尔％、至少75摩 尔％、至少80摩尔％、至少85摩尔％、至少90摩尔％、至少95摩尔％、至少96摩尔％、至 少97摩尔％、至少98摩尔％、至少99摩尔％或100摩尔％的甘油三酯。
全文摘要
一种产生甘油酯产物的方法，所述甘油酯与起始的甘油酯相比富含单不饱和脂肪酸，所述方法包含下述步骤(a)使用对饱和脂肪酸具有选择性的脂肪分解酶，和/或对甘油酯中的1-位、3-位或两者均具有选择性的脂肪分解酶醇解甘油三酯；和(b)将富含饱和脂肪酸酯的级分A与富含单不饱和甘油酯的级分B分离。
文档编号C12P7/64GK102046801SQ200980119862
公开日2011年5月4日 申请日期2009年3月25日 优先权日2008年4月7日
发明者伊·H·森, 威廉·D·考恩, 斯蒂芬·厄恩斯特, 汉斯·C·霍尔姆, 珀·M·尼尔森, 金·博尔奇 申请人:诺维信公司