本发明提供一种富含长链多不饱和脂肪酸的磷脂及其制备方法。
背景技术：
长链多不饱和脂肪酸（PUFAs）指含有两个以上双键且碳链长度为18～22个碳原子的直链脂肪酸，如EPA、DHA、DPA和ARA等对人体具有重要的生理活性，具有其他脂肪酸不可替代的作用。甘三酯和磷脂是PUFAs两种主要的天然载体，其中，甘三酯型PUFAs主要来源于深海鱼类脂肪和微生物发酵，磷脂型PUFAs则主要从南极磷虾以及深海鱼类的器官组织中进行提取。最近一些研究表明，磷脂型PUFAs比甘三酯型PUFAs具有更好的氧化稳定性和生物利用性，磷脂型PUFAs大部分可以不被水解直接被细胞吸收，具有磷脂和PUFAs的双重生理活性，因此在维持人体生理功能方面比甘三酯型PUFAs具有明显优势，磷脂型PUFAs可广泛用于食品添加剂、保健品和医药等方面。
然而，受来源限制，磷脂型PUFAs受到磷虾捕捞季节的影响以及可能存在的重金属污染等威胁，而来源丰富的大豆磷脂和蛋黄磷脂则其天然脂肪酸组成中不含PUFAs，因此，基于普通磷脂利用酶法合成含有PUFAs结构磷脂的研究正在逐步展开。
CN101701229B公开了将浓缩磷脂和不饱和油脂混合加入脂肪酶催化磷脂酯交换制备质构磷脂和卵磷脂的方法。该法以磷脂或浓缩磷脂和不饱和油脂作为原料，用脂肪酶进行催化转酯化反应，但该方法反应效率较低，反应时间长达60h左右。
CN102181498A应用高纯度海豹油游离型Ω-3不饱和脂肪酸和溶血磷脂酰胆碱，在酶非水相催化作用下，得到磷脂酰胆碱型Ω-3不饱和脂肪酸产品。该专利使用溶剂体系，反应时间长，同时在催化反应过程中，水解副反应发生严重，造成产物得率较低。
CN101195637B提供一种在亚临界R134a体系中制备富含多不饱和脂肪酸磷脂的工艺，但该方法需要高压密闭反应釜及制备亚临界气体的相关装置，设备投入大，同时反应介质R134a是一种化工原料，不适合用于食品的生产。
CN104531790A公开了一种将阴/阳离子表面活性剂溶于疏水性的烷类溶剂中制备得到微反应体系，采用磷脂酶进行催化反应即得到磷脂DHA的方法。
另外国内其它一些关于酶法制备磷脂型PUFAs的文献，也主要集中在在溶剂体系中使用固定化脂肪酶或固定化磷脂酶A1催化磷脂进行酸解或酯—酯交换的反应来进行，如金华丽等（脂肪酶催化大豆磷脂改性的研究[J]）用novozym435催化大豆磷脂与EPA-DHA酯交换，反应时间长达60h，EPA-DHA的插入率为24%左右；孙兆敏（酶法制备n-3多不饱和脂肪酸型磷脂的工艺）在无溶剂体系中用固定化磷脂酶A1催化大豆磷脂和乙酯型鱼油进行酯交换反应，EPA和DHA的插入率为25%，但磷脂水解副反应发生非常严重。
US2005282033A提供了一种酶催化制备含PUFAs的改进方法，该法在反应过程中添加胺类物质，提高了反应速率，但PUFAs的插入率和磷脂最终得率并未提高。
WO2005038037A2使用磷脂酶A1和A2进行酯化和转酯化反应制备结构磷脂，该法反应时间长，插入率不高，水解副反应发生严重。
EP0494881B1使用磷脂酶A2在溶剂体系中催化酯化反应，该法除存在以上方法的弊端外，还存在酶的来源有限而且固定化后活性不稳定等缺点。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供含长链多不饱和脂肪酸的磷脂的制备方法，包括：
（1）将原料磷脂、油脂和溶剂接触，加入酶制剂进行反应；
（2）除去溶剂后，加入固定化酶进行反应，其特征在于，在步骤（1）之后具有加入碳酰胺的步骤。
根据本发明的制备方法，其中，所述原料磷脂不含长链多不饱和脂肪酸。
根据本发明的制备方法，其中，所述原料磷脂是植物来源的磷脂或动物来源的磷脂。
根据本发明的制备方法，其中，所述植物来源的磷脂选自大豆磷脂、菜籽磷脂、葵花籽磷脂、花生磷脂、芝麻磷脂或玉米磷脂中的至少一种。
根据本发明的制备方法，其中，所述动物来源的磷脂是蛋黄磷脂。
根据本发明的制备方法，其中，所述油脂含5～60重量％的长链多不饱和脂肪酸。
根据本发明的制备方法，其中，所述油脂选自深海鱼油和微生物油脂中的至少一种。
根据本发明的制备方法，其中，所述油脂选自金枪鱼油、鲱鱼油、三文鱼油、沙丁鱼油、二十二碳六烯酸藻油或花生四烯酸油脂中的至少一种。
根据本发明的制备方法，其中，所述溶剂是乙醇溶液。
根据本发明的制备方法，其中，所述溶剂是95％乙醇溶液。
根据本发明的制备方法，其中，以重量比计，步骤（1）中所述原料磷脂和所述油脂加入量之比为1：1～1：15。
根据本发明的制备方法，其中，以重量比计，步骤（1）中所述原料磷脂和所述油脂加入量之比为1：2～1：10。
根据本发明的制备方法，其中，以重量比计，步骤（1）中所述原料磷脂和所述油脂加入量之比为1：4～1：8。
根据本发明的制备方法，其中，以重量/体积（g/mL）比计，步骤（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入总量与所述溶剂之比为1：5～1：80。
根据本发明的制备方法，其中，以重量/体积（g/mL）比计，步骤（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入总量与所述溶剂之比为1：8～1：40。
根据本发明的制备方法，其中，以重量/体积（g/mL）比计，步骤（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入总量与所述溶剂之比为1：10～1：30。
根据本发明的制备方法，其中，以重量/体积（g/mL）比计，步骤（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入总量与所述溶剂之比为1：12～1：18。
根据本发明的制备方法，其中，步骤（1）中所述的酶制剂为游离酶形式。
根据本发明的制备方法，其中，步骤（1）中所述的酶制剂选自磷脂酶A1，磷脂酶A2或脂肪酶中的至少一种。
根据本发明的制备方法，其中，步骤（1）中所述的酶制剂来源于黑曲霉（Aspergillus niger）、南极假丝酵母（Candida antarctic）、皱褶假丝酵母（Candida rugosa）、柱状假丝酵母（Candida cylindracea）、嗜热真菌（Thermomyces lanuginosus）、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）、米黑毛霉（Mucor miehei）、德氏根霉（Rhizopus delemar）、米根霉菌（Rhizopus oryzae）、 假单胞细菌属（Pseudononas sp. ）中的至少一种。
根据本发明的制备方法，其中，以重量/体积（g/mL）比计，步骤（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入总量与所述酶制剂之比为10：1～200：1。
根据本发明的制备方法，其中，以重量/体积（g/mL）比计，步骤（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入总量与所述酶制剂之比为20：1～100：1。
根据本发明的制备方法，其中，以重量/体积（g/mL）比计，步骤（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入总量与所述酶制剂之比为40：1～80：1。
根据本发明的制备方法，其中，以重量/体积（g/mL）比计，步骤（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入总量与所述酶制剂之比为50：1～60：1。
根据本发明的制备方法，其中，相对于所述原料磷脂和所述油脂的加入总量100重量份，以重量比计，所述碳酰胺的加入量为100重量份～800重量份。
根据本发明的制备方法，其中，相对于所述原料磷脂和所述油脂的加入总量100重量份，以重量比计，所述碳酰胺的加入量为200重量份～600重量份。
根据本发明的制备方法，其中，相对于所述原料磷脂和所述油脂的加入总量100重量份，以重量比计，所述碳酰胺的加入量为250重量份～350重量份。
根据本发明的制备方法，其中，所述步骤（2）在温度为60～80℃下进行。
根据本发明的制备方法，其中，所述步骤（2）的固定化酶为固定于大孔吸附树脂或碱性离子交换树脂载体的脂肪酶或磷脂酶的至少一种。
根据本发明的制备方法，其中，以重量比计，所述原料磷脂和所述油脂的加入总量与所述固定化酶的重量比为10：1～200：1。
根据本发明的制备方法，其中，以重量比计，所述原料磷脂和所述油脂的加入总量与所述固定化酶的重量比为20：1～150：1。
根据本发明的制备方法，其中，所述步骤（2）在抽真空或保护气体气氛下进行反应。
根据本发明的制备方法，其中，所述步骤（2）的保护气体气氛是惰性气体气氛。
根据本发明的制备方法，其中，所述步骤（2）中加入吸水剂。
根据本发明的制备方法，其中，所述吸水剂选自分子筛或高分子吸水树脂中的至少一种。
根据本发明的制备方法，其中，所述高分子吸水树脂选自丙烯酰胺-丙烯酸盐共聚交联物和淀粉接枝丙烯酸盐共聚交联物中的至少一种。
根据本发明的制备方法，其中，所述原料磷脂的磷脂酰胆碱含量为15～60重量％。
根据本发明的制备方法，所述长链多不饱和脂肪酸是含有两个以上双键且碳原子数为18～22的直链脂肪酸。
根据本发明的制备方法，所述长链多不饱和脂肪酸是选自二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸和花生四烯酸中的至少一种。
根据本发明的制备方法，所述的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂的磷脂酰胆碱含量为70～85重量％。
根据本发明的制备方法，所述的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂的脂肪酸组成中，多不饱和脂肪酸含量为15～60重量%。
根据本发明的制备方法，所述的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂的脂肪酸组成中，多不饱和脂肪酸含量为25～52重量%。
本发明的另一个目的是提供含长链多不饱和脂肪酸的磷脂，其是通过权利要求100～135中任意一项所述的制备方法制备的。
根据本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂，其磷脂酰胆碱含量为70～85重量％。
根据本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂，其脂肪酸组成中，多不饱和脂肪酸含量为15～60重量％。
根据本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂，其脂肪酸组成中，多不饱和脂肪酸含量为25～52重量%。
根据本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂，所述长链多不饱和脂肪酸是含有两个以上双键且碳原子数为18～22的直链脂肪酸。
根据本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂，所述长链多不饱和脂肪酸是选自二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸和花生四烯酸中的至少一种。
本发明的另一个目的是提供含长链多不饱和脂肪酸的磷脂酰胆碱，其脂肪酸组成中，多不饱和脂肪酸含量为20～80重量％。
根据本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂酰胆碱，其脂肪酸组成中，多不饱和脂肪酸含量为30～60重量%。
根据本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂酰胆碱，所述长链多不饱和脂肪酸是含有两个以上双键且碳原子数为18～22的直链脂肪酸。
根据本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂酰胆碱，所述长链多不饱和脂肪酸是选自二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸和花生四烯酸中的至少一种。
发明效果
本发明主要有以下优点：(1) 无需高纯度长链多不饱和脂肪酸酰基供体和高纯度的磷脂酰胆碱（或溶血磷脂酰胆碱）作反应原料，大大减少了价格成本。(2) 反应产物中长链多不饱和脂肪酸和磷脂酰胆碱含量显著提高，实现了磷脂中长链多不饱和脂肪酸的接入和磷脂酰胆碱提纯的目的，显著提升产品附加值。
本方法无需采用高纯度磷脂酰胆碱（PC）和高纯度的长链多不饱和脂肪酸原料，工艺简单，反应产物中长链多不饱和脂肪酸插入率高且磷脂酰胆碱含量提高到70%以上，大大提升了产品的附加值。
具体实施方式
多不饱和脂肪酸（PUFA）按照从甲基端开始第1个双键的位置不同，可分为ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸。ω-3不饱和脂肪酸中对人体最重要的两种不饱和脂肪酸是DHA和EPA。EPA是二十碳五烯酸的英文缩写，具有清理血管中的垃圾（胆固醇和甘油三酯）的功能，俗称"血管清道夫"。DHA是二十二碳六烯酸的英文缩写，具有软化血管、健脑益智、改善视力的功效，俗称"脑黄金"。
含长链多不饱和脂肪酸的磷脂的制备方法
本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂的制备方法，包括：
（1）将原料磷脂、油脂和溶剂接触，加入酶制剂进行反应；
（2）除去溶剂后，加入固定化酶进行反应，其特征在于，在步骤（1）之后具有加入碳酰胺的步骤。
本发明中，所述长链多不饱和脂肪酸是指含有两个以上双键且碳原子数为18～22的直链脂肪酸，如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）、二十二碳五烯酸（DPA）和花生四烯酸（ARA）等。
在本发明中，所述原料磷脂是植物来源的磷脂或动物来源的磷脂。所述植物来源的磷脂选自大豆磷脂、菜籽磷脂、葵花籽磷脂、花生磷脂、芝麻磷脂或玉米磷脂中的至少一种。所述动物来源的磷脂是蛋黄磷脂。本发明中的原料磷脂不含长链多不饱和脂肪酸。
本发明中“不含长链多不饱和脂肪酸”是指通过本发明的中所述的测定方法未检测出长链多不饱和脂肪酸。本发明的“原料磷脂”是指反应中作为原料使用的磷脂。本发明的“含长链多不饱和脂肪酸的磷脂”是指通过上述含长链多不饱和脂肪酸的磷脂的制备方法制备获得的磷脂。在本发明中，所述油脂含5～60重量％、优选10～55重量％、更优选20～45重量％的长链多不饱和脂肪酸。在本发明的具体实施方式中，所述油脂含16.2重量％、22.7重量％、27重量％、28.6重量％、40重量％或50重量％的长链多不饱和脂肪酸。
所述油脂选自深海鱼油和微生物油脂中的至少一种。所述油脂选自金枪鱼油、鲱鱼油、三文鱼油、沙丁鱼油、二十二碳六烯酸藻油或花生四烯酸油脂中的至少一种。
在本发明中，所述溶剂是乙醇溶液，优选是95％乙醇溶液。
在本发明的优选实施方式中，以重量比计，步骤（1）中所述原料磷脂和所述油脂加入量之比为1：1～1：20，优选为1：1～1：15，更优选为1：2～1：10，进一步优选为1：4～1：8。
在本发明的具体实施方式中，以重量比计，步骤（1）中所述原料磷脂和所述油脂加入量之比为1：1、1：2、1：4、1：5、1：8、1：10、1：15。
在本发明的优选实施方式中，以重量/体积（g/mL）比计，步骤（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入总量与所述溶剂之比为1：2～1：100，优选为1：5～1：80，更优选为1：8～1：40，进一步优选为1：10～1：30，特别优选为1：12～1：20，最优选为1：12～1：18。
在本发明的具体实施方式中，以重量/体积（g/mL）比计，步骤（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入总量与所述溶剂之比为1：5、1：8、1：10、1：12、1：18、1：20、1：30、1：40。
在本发明的优选实施方式中，步骤（1）中所述的酶制剂为游离酶形式。步骤（1）中所述的酶制剂选自磷脂酶A1，磷脂酶A2或脂肪酶中的至少一种。
在本发明的优选实施方式中，步骤（1）中所述的酶制剂来源于黑曲霉（Aspergillus niger）、南极假丝酵母（Candida antarctic）、皱褶假丝酵母（Candida rugosa）、柱状假丝酵母（Candida cylindracea）、嗜热真菌（Thermomyces lanuginosus）、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）、米黑毛霉（Mucor miehei）、德氏根霉（Rhizopus delemar）、米根霉菌（Rhizopus oryzae）、 假单胞细菌属（Pseudononas sp. ）中的至少一种。
在本发明的优选实施方式中，以重量/体积（g/mL）比计，步骤（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入总量与所述酶制剂之比为10：1～200：1，优选为20：1～100：1，更优选为40：1～80：1，进一步为50：1～60：1。
在本发明的具体实施方式中，以重量/体积（g/mL）比计，步骤（1）中所述原料磷脂和所述油脂的加入总量与所述酶制剂之比为20：1、30：1、45：1、55：1、60：1、80：1、100：1。
在本发明的优选实施方式中，相对于所述原料磷脂和所述油脂的加入总量100重量份，以重量比计，所述碳酰胺的加入量为100重量份～800重量份，优选为200重量份～600重量份，更优选为250重量份～350重量份。
在本发明的具体实施方式中，相对于所述原料磷脂和所述油脂的加入总量100重量份，以重量比计，所述碳酰胺的加入量为100重量份、200重量份、267重量份、300重量份、350重量份、400重量份、600重量份。
本发明中，所述步骤（1）的反应条件没有特别限定，只要能够实现本发明的目的即可。例如可以在30～40℃、例如35℃下进行。反应时间例如为1～10小时，优选为2～6小时。
在加入碳酰胺进行反应之后，可以在0～4℃下进行结晶处理，分理出过滤液。结晶处理的时间例如是1～6小时，优选2～4小时。随后将过滤液通过蒸馏（例如旋蒸）除去溶剂。
本发明中，所述步骤（2）在温度为60～80℃下进行。反应时间例如为2～10小时，优选为4～8小时。所述步骤（2）在抽真空或保护气体气氛下进行反应。抽真空例如为0.1～5KPa。所述步骤（2）的保护气体气氛是惰性气体气氛，例如是氮气气氛。
在本发明的优选实施方式中，所述步骤（2）的固定化酶为固定于大孔吸附树脂或碱性离子交换树脂载体的脂肪酶或磷脂酶的至少一种。所述脂肪酶或磷脂酶是毛霉属、青霉属、曲霉属、根霉属、嗜热真菌属、假单胞细菌属以及假丝酵母来源的微生物生产的脂肪酶或磷脂酶。所述固定化酶可以通过商购获得，例如，novozyme 435、Lipozyme RM IM，或者通过CN201310307403.6以及文献Vikbjerg， Huiling Mu， Xuebing Xu，Synthesis of structured phospholipids by immobilized phospholipase A2 catalyzed acidolysis，Journal of Biotechnology， 2007，128：545～554等中记载的方法获得，例如固定化磷脂酶A1、固定化磷脂酶A2等。
在本发明的优选实施方式中，以重量比计，所述原料磷脂和所述油脂的加入总量与所述固定化酶的重量比为10：1～200：1，优选为20：1～150：1，更优选为40：1～100：1，进一步为50：1～60：1。
在本发明的具体实施方式中，以重量比计，所述原料磷脂和所述油脂的加入总量与所述固定化酶的重量比为25：1、29：1、30：1、50：1、55：1、60：1、67：1、100：1。
在本发明中，所述步骤（2）中加入吸水剂。所述吸水剂的加入量可以适当确定，以重量比计，所述原料磷脂和所述油脂的加入总量与所述吸水剂的重量比为10：1～50：1，优选为15：1～40：1。例如以重量比计，所述原料磷脂和所述油脂的加入总量与所述吸水剂的重量比为16：1、17：1、22：1、30：1。
所述吸水剂选自分子筛或高分子吸水树脂中的至少一种。所述分子筛例如为3A分子筛。所述高分子吸水树脂选自丙烯酰胺-丙烯酸盐共聚交联物和淀粉接枝丙烯酸盐共聚交联物中的至少一种。
在本发明中，所述原料磷脂的磷脂酰胆碱含量为15～60重量％，例如为16重量％、18重量％、22重量％、60重量％。
反应结束后，通过常规方法过滤除去固定化酶，加入溶剂（例如丙酮等）进行洗涤，然后通过离心处理（例如在8000～10000r/min下）。
通过上述本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂的制备方法制备，可以制备含长链多不饱和脂肪酸的磷脂。
通过上述本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂的制备方法制备的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂，其磷脂酰胆碱含量为70～85重量％，例如为70重量％、72重量％、73重量％、74重量％、78重量％、81重量％、82重量％、85重量％。
通过上述本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂的制备方法制备的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂，其脂肪酸组成中，多不饱和脂肪酸含量为20～80重量％，优选为30～60重量%，例如为24.7重量％、30重量％、38重量％、41.5重量％、44.7重量％、45.9重量％、63.3重量％、76.3重量％。由于本发明中的原料磷脂不含长链多不饱和脂肪酸，因此本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂的多不饱和脂肪酸含量也可以看作是多不饱和脂肪酸含量提高率。
本发明通过上述本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂的制备方法制备的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂，其脂肪酸组成中，DPA为12.9重量％、DHA为38.7重量％；EPA为5.5重量％、DHA为21.6重量％；EPA为3.8重量％、DHA为27.3重量％；ARA为40.2重量％；EPA为28.6重量％、DHA为32.4重量％；DPA为8.9重量％、DHA为20.7重量％；EPA为8.6重量％、DHA为30.2重量％；EPA为2.7重量％、DHA为25.2重量％；或EPA为7.6重量％、DHA为12.4重量％。
含长链多不饱和脂肪酸的磷脂
本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂，其磷脂酰胆碱含量为70～85重量％，例如为70重量％、72重量％、73重量％、74重量％、78重量％、81重量％、82重量％、85重量％。
本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂，其脂肪酸组成中，多不饱和脂肪酸含量为15～60重量％，优选为25～52重量%，例如为20重量％、27.1重量％、27.9重量％、29.6重量％、31.1重量％、38.8重量％、40.2重量％、51.6重量％、61重量％。由于本发明中的原料磷脂不含长链多不饱和脂肪酸，因此本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂的多不饱和脂肪酸含量也可以看作是相对于原料磷脂，产物磷脂的多不饱和脂肪酸含量提高率。本发明中，所述长链多不饱和脂肪酸是指含有两个以上双键且碳原子数为18～22的直链脂肪酸，如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）、二十二碳五烯酸（DPA）和花生四烯酸（ARA）等。
本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂，其脂肪酸组成中，DPA为12.9重量％、DHA为38.7重量％；EPA为5.5重量％、DHA为21.6重量％；EPA为3.8重量％、DHA为27.3重量％；ARA为40.2重量％；EPA为28.6重量％、DHA为32.4重量％；DPA为8.9重量％、DHA为20.7重量％；EPA为8.6重量％、DHA为30.2重量％；EPA为2.7重量％、DHA为25.2重量％；或EPA为7.6重量％、DHA为12.4重量％。
含长链多不饱和脂肪酸的磷脂酰胆碱
从本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂将磷脂酰胆碱进行分离（分离方法参照文献Reddy, J. R. C., Vijeeta, T., Karuna, M. S. L., Rao, B. V. S., & Prasad, R. B. N. (2005)，Lipase-Catalyzed Preparation of Palmitic and Stearic Acid-rich Phosphatidylcholine，Journal of the American Oil Chemists’ Society, 82(10), 727–730），分离得到磷脂酰胆碱（有时也称为本发明的磷脂酰胆碱或本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂酰胆碱），然后将分离得到的磷脂酰胆碱进行预处理和脂肪酸测定，方法分别参照国家标准GB/T 17376-2008和GB/T 24894-2008。
在上述的磷脂酰胆碱的脂肪酸组成中，多不饱和脂肪酸含量为20～80重量％，优选为30～60重量%，例如为24.7重量％、30重量％、38重量％、41.5重量％、44.7重量％、45.9重量％、63.3重量％、76.3重量％。由于本发明中的原料磷脂不含长链多不饱和脂肪酸，因此本发明的磷脂酰胆碱的多不饱和脂肪酸含量也可以看作是相对于原料磷脂，分离得到的磷脂酰胆碱的多不饱和脂肪酸含量提高率。
本发明的含长链多不饱和脂肪酸的磷脂酰胆碱，其脂肪酸组成中，DPA为18.1重量％、DHA为45.2重量％；EPA为7.4重量％、DHA为30.6重量％；EPA为9.1重量％、DHA为35.6重量％；ARA为57.1重量％；EPA为36.2重量％、DHA为40.1重量％；DPA为12.8重量％、DHA为28.7重量％；EPA为10.3重量％、DHA为35.6重量％；EPA为3.2重量％、DHA为26.8重量％；或EPA为8.9重量％、DHA为15.8重量％。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例
下述实施例中使用的磷脂酶A1、磷脂酶A2、脂肪酶TLL、脂肪酶Candida cylindracea、脂肪酶pseudononas sp.、脂肪酶Rhizopus oryzae分别为商品化的Lecitase® Ultra，Lecitase 10L、Lipozyme® TL 100L、 Lipase AY“Amano” 30、Lipase from Pseudononas sp.、Lipase F-AP 15。
下述实施例中使用的固定化脂肪酶Novozyme 435购自Novozymes公司，固定化磷脂酶A1和固定化磷脂酶A2是以现有公开专利方法得到，如CN201310307403.6以及文献Vikbjerg，Huiling Mu，Xuebing Xu，Synthesis of structured phospholipids by immobilized phospholipase A2 catalyzed acidolysis，Journal of Biotechnology， 2007，128：545～554等。
下述实施例中，使用的原料来源如下：大豆粉末磷脂和蛋黄磷脂购自北京美亚斯磷脂技术有限公司；DHA藻油和ARA油脂购自厦门汇盛生物有限公司；金枪鱼油、鲱鱼油和沙丁鱼油购自Norsk Hydro A/S。
磷脂酰胆碱（PC）含量的测定方法是按照国家标准GB/T 21493-2008中的方法测定的；磷脂脂肪酸组成的测定方法是按照国家标准GB/T 24894-2008中的方法测定的，其中预处理方法是按照国家标准GB/T 17376-2008的方法进行的；PC脂肪酸组成测定首先将PC从产物中分离出来，分离方法参照文献Reddy, J. R. C., Vijeeta, T., Karuna, M. S. L., Rao, B. V. S., & Prasad, R. B. N. (2005)，Lipase-Catalyzed Preparation of Palmitic and Stearic Acid-rich Phosphatidylcholine，Journal of the American Oil Chemists’ Society, 82(10), 727–730，然后进行预处理和脂肪酸测定，方法分别参照国家标准GB/T 17376-2008和GB/T 24894-2008。
实施例1
称取15g大豆粉末磷脂（PC含量为18%）、30g DHA藻油（DHA 35%，DPA 15%）和450mL 95%乙醇于反应瓶中，在35℃条件下搅拌均匀后，加入0.5mL磷脂酶A1和1mL脂肪酶TL L，反应4h后，加入90g碳酰胺，待完全溶解后，将反应瓶置于0℃环境中结晶2h，过滤分离出滤液，70℃旋蒸除去乙醇后，加入1.5g novozyme 435，抽取真空至5KPa~0.1KPa，70℃条件下反应6h。待反应完成后，过滤除去Novozyme 435（可回收重复利用），加入30mL丙酮洗涤3次，10000r/min离心得到丙酮不溶物。检测结果见表1。
表1
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比较实施例1
（1）称取15g大豆粉末磷脂（PC含量为18%）和150mL 95%乙醇于反应瓶中，在35℃条件下搅拌均匀后，加入0.5mL磷脂酶A1，反应4h后， 70℃旋蒸除去乙醇；（2）称取30g DHA藻油（DHA 35%，DPA 15%）和300mL 95%乙醇于反应瓶中，加入1mL脂肪酶TL L，反应4h后，加入90g碳酰胺，待完全溶解后，将反应瓶置于0℃环境中结晶2h，过滤分离出滤液，70℃旋蒸除去乙醇；（3）将步骤（1）和步骤（2）所得产物混合后，加入1.5g novozyme 435，70℃条件下抽取真空5KPa~0.1KPa，反应6h。待反应完成后，过滤除去novozyme 435（可回收重复利用），加入30mL丙酮洗涤3次，10000r/min离心得到丙酮不溶物，检测结果如下表2所示。
表2
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比较实施例2
称取15g大豆粉末磷脂（PC含量为18%）、30g DHA藻油（DHA 35%，DPA 15%）和450mL 95%乙醇于反应瓶中，在35℃条件下搅拌均匀后，加入0.5mL磷脂酶A1和1mL脂肪酶TL L，反应4h后， 70℃旋蒸除去乙醇；加入1.5g novozyme 435，抽取真空至5KPa~0.1KPa，70℃条件下反应6h。待反应完成后，过滤除去novozyme 435（可回收重复利用），加入30mL丙酮洗涤3次，10000r/min离心得到丙酮不溶物。检测结果见表3。
表3
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比较实施例3
称取5g大豆卵磷脂（PC含量为60%）和15g DHA浓缩液（DPA和DHA总含量为97.2%），加入2g novozyme 435，抽取真空至5KPa~0.1KPa，70℃条件下反应6h。待反应完成后，过滤除去novozyme 435（可回收重复利用），加入30mL丙酮洗涤3次，10000r/min离心得到丙酮不溶物。检测结果见表4。
表4
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实施例2
称取10g蛋黄磷脂（PC含量为60%）、100g金枪鱼油（DHA 18.2%，EPA 4.5%）和2.2L 95%乙醇于反应瓶中，在35℃条件下搅拌均匀后，加入1mL磷脂酶A1和1mL脂肪酶Candida cylindracea，反应2h后，加入440g碳酰胺，待完全溶解后，将反应瓶置于4℃环境中结晶4h，过滤分离出滤液，旋蒸除去乙醇后，加入2g的固定化磷脂酶A1和5g 3A分子筛，充氮条件下60℃反应8h。待反应完成后，过滤除去固定化磷脂酶A1（可回收重复利用），加入20mL丙酮洗涤3次，8000r/min离心得到丙酮不溶物。检测结果见表5。
表5
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实施例3
称取10g大豆粉末磷脂（PC含量为18%）、80g鲱鱼油（DHA 20.1%，EPA 8.5%）和720mL 95%乙醇于反应瓶中，在35℃条件下搅拌均匀后，加入0.8mL磷脂酶A2和1.2mL脂肪酶Pseudononas sp.，反应4h后，加入270g碳酰胺，待完全溶解后，将反应瓶置于0℃环境中结晶4h，过滤分离出滤液，旋蒸除去乙醇后，加入1.8g固定化磷脂酶A2和3g 高分子吸水树脂（丙烯酰胺-丙烯酸盐共聚交联物），充氮条件下70℃反应8h。待反应完成后，过滤除去固定化磷脂酶A2（可回收重复利用），加入30mL丙酮洗涤3次，8000r/min离心得到丙酮不溶物。检测结果见表6。
表6
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实施例4
称取20g大豆粉末磷脂（PC含量为16%）、100g ARA油脂（ARA 40%）和2.16L 95%乙醇于反应瓶中，在35℃条件下搅拌均匀后，加入0.5mL磷脂酶A1和1mL脂肪酶Rhizopus oryzae，反应3h后，加入240g碳酰胺，待完全溶解后，将反应瓶置于2℃环境中结晶3h，过滤分离出滤液，旋蒸除去乙醇后，加入2g Novozyme 435，抽取真空至5KPa~0.1KPa，80℃反应4h。待反应完成后，过滤除去novozyme 435（可回收重复利用），加入40mL丙酮洗涤3次，10000r/min离心得到丙酮不溶物。检测结果见表7。
表7
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实施例5
称取20g大豆粉末磷脂（PC含量为22%）、160g 沙丁鱼油（DHA 16.8%，EPA 10.2%）和900mL 95%乙醇于反应瓶中，在35℃条件下搅拌均匀后，加入1mL磷脂酶A1和2mL脂肪酶TL L，反应4h后，加入480g碳酰胺，待完全溶解后，将反应瓶置于0℃环境中结晶4h，过滤分离出滤液，旋蒸除去乙醇后，加入1.8g Novozyme 435，抽取真空至5KPa~0.1KPa ，75℃反应4h。待反应完成后，过滤除去novozyme 435（可回收重复利用），加入35mL丙酮洗涤3次，8000r/min离心得到丙酮不溶物。检测结果见表8。
表8
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实施例6
称取15g大豆粉末磷脂（PC含量为18%）、15g DHA藻油（DHA 35%，DPA 15%）和360mL 95%乙醇于反应瓶中，在35℃条件下搅拌均匀后，加入0.1mL磷脂酶A1和0.2mL脂肪酶TL L，反应6h后，加入30g碳酰胺，待完全溶解后，将反应瓶置于0℃环境中结晶5h，过滤分离出滤液，70℃旋蒸除去乙醇后，加入0.45g novozyme 435，抽取真空至5KPa~0.1KPa，70℃条件下反应8h。待反应完成后，过滤除去novozyme 435（可回收重复利用），加入15mL丙酮洗涤3次，10000r/min离心得到丙酮不溶物。检测结果见表9。
表9
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实施例7
称取10g蛋黄磷脂（PC含量为60%）、150g金枪鱼油（DHA 18.2%，EPA 4.5%）和4.8L 95%乙醇于反应瓶中，在35℃条件下搅拌均匀后，加入1mL磷脂酶A1和7mL脂肪酶TLL，反应2h后，加入960g碳酰胺，待完全溶解后，将反应瓶置于2℃环境中结晶4h，过滤分离出滤液，旋蒸除去乙醇后，加入5.6g的固定化磷脂酶A1和10g 3A分子筛，充氮条件下60℃反应8h。待反应完成后，过滤除去固定化磷脂酶A1（可回收重复利用），加入30mL丙酮洗涤3次，8000r/min离心得到丙酮不溶物。检测结果见表10。
表10
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实施例8
称取10g大豆粉末磷脂（PC含量为18%）、40g鲱鱼油（DHA 20.1%，EPA 8.5%）和2L 95%乙醇于反应瓶中，在35℃条件下搅拌均匀后，加入0.5mL磷脂酶A2和0.75mL脂肪酶Pseudononas sp.，反应5h后，加入175g碳酰胺，待完全溶解后，将反应瓶置于0℃环境中结晶4h，过滤分离出滤液，旋蒸除去乙醇后，加入2g固定化磷脂酶A2和3g 高分子吸水树脂（淀粉接枝丙烯酸盐共聚交联物），充氮条件下65℃反应8h。待反应完成后，过滤除去固定化磷脂酶A2（可回收重复利用），加入30mL丙酮洗涤3次，8000r/min离心得到丙酮不溶物。检测结果见表11。
表11
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实施例9
称取10g蛋黄磷脂（PC含量为60%）、40g三文鱼油（DHA9.5%，EPA6.7%）和2L 95%乙醇于反应瓶中，在35℃条件下搅拌均匀后，加入0.5mL磷脂酶A2和0.75mL脂肪酶Rhizopus oryzae，反应3h后，加入175g碳酰胺，待完全溶解后，将反应瓶置于0℃环境中结晶4h，过滤分离出滤液，旋蒸除去乙醇后，加入2g固定化磷脂酶A2，抽取真空至5KPa~0.1KPa，70℃条件下反应6h。待反应完成后，过滤除去固定化磷脂酶A2（可回收重复利用），加入30mL丙酮洗涤3次，8000r/min离心得到丙酮不溶物。检测结果见表11。
表12
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以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。