一种不饱和脂肪酸固相微萃取方法与流程

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种不饱和脂肪酸固相微萃取方法。

背景技术：

不饱和脂肪酸是食用植物油的主要组成成分，不饱和脂肪酸中所带有的碳碳双键有顺式和反式两种存在形式：顺式键形成的不饱和脂肪酸室温下是液态，反式键形成的不饱和脂肪酸室温下是固态。在现代食品工业中，为防止油脂变质和改善加工食品风味，人们对植物油进行部分氢化处理得到部分氢化植物油。部分氢化植物油中所含的大量不饱和脂肪酸都是室温下可呈现固态的反式脂肪酸（trans-fattyacid,tfa）。因此，部分氢化油具有耐高温、不易变质、存放时间久等优点，并在蛋糕、饼干、速溶咖啡、速冻比萨饼、薯条、爆米花等食品加工过程中得到普遍使用。研究表明，食用过多的tfa会增加心血管疾病风险、降低红细胞对胰岛素的反应、促生糖尿病、升高胆固醇、导致必需脂肪酸的缺乏和影响婴幼儿的生长发育等。世界卫生组织提出tfa摄入所占能量应该控制在小于摄入食品总能量的1%。针对当前工业化食品中广泛含有tfa的现象，开发快速准确的tfa检测方法势在必行。目前，tfa检测的主要难点在于因tfa与食品中大量存在的其顺式异构体——顺式脂肪酸（cis-fattyacid,cfa）的结构非常相近，导致其难以区分，对定性和定量分析造成较大的影响。

固相微萃取（solidphasemicroextraction,spme）是一种新型的样品前处理方法，具有简便、快速、高效、有机溶剂消耗量低、易与其他仪器联用等优点，在分析化学领域受到了广泛的关注。spme的萃取原理是基于样品组分与固定相之间的分配平衡，因此开发新型spme固定相成为了spme方法的核心。据文献报道，银纳米粒与不饱和化合物所带有的碳碳双键之间存在着特殊的作用力，这种作用力随着双键数量的增加而提高，随着碳链的增长而变小，同时顺式不饱和化合物的作用力要强于反式不饱和化合物。由此启发，本课题组将银纳米粒与spme技术相结合，制备了银纳米粒固定化spme整体柱，并基于该整体柱，结合管内固相微萃取-高效液相色谱（in-tubespme-hplc）联用系统，发展一种不饱和脂肪酸固相微萃取新方法，实现不饱和脂肪酸的高效富集和不同顺反异构体的顺序洗脱，满足反式脂肪酸高效检测要求。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种不饱和脂肪酸固相微萃取新方法。本发明是以银纳米粒固定化整体柱作为固相微萃取整体柱，结合管内固相微萃取-高效液相色谱（in-tubespme-hplc）联用系统，建立不饱和脂肪酸固相微萃取新方法。得益于负载的银纳米粒与不饱和脂肪酸碳碳双键之间的相互作用实现不饱和脂肪酸的富集；并利用银纳米粒与不饱和脂肪酸不同异构体之间作用力的不同，实现不饱和脂肪酸不同异构体的顺序洗脱。该固相微萃取方法可实现油酸甲酯（主要是顺-6-十八碳烯酸甲酯、反-6-十八碳烯酸甲酯、顺-9-十八碳烯酸甲酯、反-9-十八碳烯酸甲酯）、亚油酸甲酯（主要是顺-9,顺-12-十八碳二烯酸甲酯、顺-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯、反-9,顺-12-十八碳二烯酸甲酯、反-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯）等食品中常见不饱和脂肪酸类化合物的高效富集、顺序洗脱，并满足反式脂肪酸高效检测要求。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种不饱和脂肪酸固相微萃取新方法，其是以银纳米粒固定化整体柱作为固相微萃取整体柱，结合管内固相微萃取-高效液相色谱联用系统得以构建。所述的不饱和脂肪酸固相微萃取新方法，包括以下步骤：

1）银纳米粒固定化固相微萃取整体柱的制备：

所述的银纳米粒固定化整体柱是基于粘多糖功能化整体柱制备的，即先由粘多糖、尿素溶液、甲醛溶液在催化剂溶液作用下原位脱水缩聚制备粘多糖功能化整体柱；再制备性能稳定、分散性良好的球形银纳米粒溶液，在微量注射泵辅助下，将银纳米粒固定化到粘多糖功能化整体柱表面。

其中，粘多糖功能化整体柱的制备配方按质量百分数之和为100%计，各组分占整体柱制备配方组成总质量的百分比为：粘多糖0.1~1%、尿素溶液38~52%、甲醛溶液34~47%、催化剂7.5~9.5%。

其中，所述粘多糖为透明质酸钠或硫酸软骨素；

所述尿素溶液，其浓度为1g/ml；

所述甲醛溶液，其中甲醛的质量浓度为33%~37%；

所述催化剂为盐酸溶液，其浓度为0.20mol/l；

所述银纳米粒溶液通过如下方式制备：将1mmol/lagno3溶液、2.8mmol/l酒石酸钾钠溶液和2mmol/l柠檬酸钠溶液等体积混合，调节混合溶液ph值为10，即得到平均粒径在30nm左右、紫外-可见光吸收光谱350~450nm区段有明显吸收峰、尺寸分布区间狭窄、性能稳定、分散性良好的1mmol/l球形银纳米粒溶液。

2）管内固相微萃取-高效液相色谱（in-tubespme-hplc）联用系统的构建：所述的管内固相微萃取-高效液相色谱联用系统由微萃取和分析两部分组成，结构如附图1所示。微萃取部分包括：一个六通阀（v1）、一台液相色谱输液泵（泵a）、0.5mlpeek管定量环。分析部分包括：一台液相色谱输液泵（泵b）、一个六通阀（v2）、银纳米粒固定化固相微萃取整体柱、氨基分析柱、二极管阵列检测器。

3）不饱和脂肪酸固相微萃取：

首先，六通阀v1和v2都在load位置。装载液通过泵a平衡银纳米粒固定化固相微萃取整体柱，流速为0.1ml/min。流动相通过泵b直接经分析柱以获得色谱分离要求的稳定基线，流速为1.0ml/min。同时，通过进样针将样品溶液注满定量环。

当六通阀v1调至inject位置，固相微萃取开始，定量环中的样品经由装载液带入固相微萃取整体柱，经过给定的时间，六通阀v1调回load位置，装载液继续冲洗固相微萃取整体柱90s以消除残留的样品溶液，降低其干扰。

然后，泵b流速设置为0.1ml/min，六通阀v2调节至inject位置，利用流动相将固相微萃取整体柱上富集的分析对象顺序洗脱。当洗脱完成时，六通阀v2调节至load位置，设置泵b流速为1.0ml/min进行分析检测。

所述的装载液组成为正己烷/异丙醇=95%/5%(v/v)；所述的流动相为正己烷；所述的分析柱为氨基色谱柱，柱温箱温度为30℃，检测波长为203nm。

本发明的显著优点在于：

1）由于顺反式脂肪酸极为相似的化学结构，其他常规spme材料与两者的作用力往往都是相同的，因此通常只能实现富集，而难以实现顺序洗脱。与其他常规spme材料不同，银纳米粒固定化整体柱得益于负载的银纳米粒与不饱和脂肪酸不同异构体之间作用力的不同，可实现不饱和脂肪酸不同异构体的顺序洗脱，提高顺反式脂肪酸的分离度，满足反式脂肪酸高效检测的要求。

2）银纳米粒固定化整体柱是利用银纳米粒与不饱和脂肪酸碳碳双键之间的相互作用实现不饱和脂肪酸的富集，而对饱和脂肪酸没有富集能力，降低了食品样品中存在的大量饱和脂肪酸对不饱和脂肪酸检测的干扰，提高了分离度和检测灵敏度。

3）本发明方法简单，工艺巧妙，所需仪器普及度较高，易于推广。

附图说明

图1是管内固相微萃取-高效液相色谱（in-tubespme-hplc）联用系统的结构示意图。

图2是以不同整体柱作为固相微萃取整体柱，建立管内固相微萃取-高效液相色谱(in-tubespme-hplc)联用系统对两种油酸甲酯顺反异构体（顺-9-十八碳烯酸甲酯、反-9-十八碳烯酸甲酯）的色谱分离图。

图中a曲线反映的是以粘多糖功能化整体柱作为固相微萃取整体柱，b曲线反映的是以银纳米粒固定化整体柱作为固相微萃取整体柱。

图3是以不同整体柱作为固相微萃取整体柱，建立in-tubespme-hplc联用系统对亚油酸甲酯四种顺反异构体混合物（反-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯、顺-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯、反-9,顺-12-十八碳二烯酸甲酯、顺-9,顺-12-十八碳二烯酸甲酯）的色谱分离图。

图中a曲线反映的是以粘多糖功能化整体柱作为固相微萃取整体柱，b曲线反映的是以银纳米粒固定化整体柱作为固相微萃取整体柱。

具体实施方式

为了使本发明所述内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

步骤一、银纳米粒固定化固相微萃取整体柱的制备：

1.粘多糖功能化整体柱的制备：

1)ptfe管空柱的清洗：将内径为750μmptfe管接上液相泵，用色谱纯甲醇在0.5ml/min流速下冲洗10min，除去管内壁残留的有机物杂质等，然后通氮气，并置于60℃的烘箱中烘干10min。

2)管内快速缩聚：将8mg透明质酸钠，550mg1g/ml尿素溶液，450mg甲醛溶液，100mg0.2mol/l盐酸溶液均匀混合，快速超声振荡1~2min，然后将混合物快速注满经清洗干燥的ptfe管（或peek管）中，两端封闭并浸于70℃水浴中恒温加热10min；待反应完成后，以水为流动相，在液相色谱泵上冲洗ptfe管整体色谱柱约1h，冲去床层内残留的溶剂和反应残留试剂，即得到粘多糖功能化整体柱。

2.银纳米粒溶液的制备：将1mmol/lagno3溶液、2.8mmol/l酒石酸钾钠溶液、2mmol/l柠檬酸钠溶液等体积混合，振荡超声，调节混合溶液ph值为10，即还原得到平均粒径在30nm左右、紫外-可见光吸收光谱350~450nm区段有明显吸收峰、尺寸分布区间狭窄、性能稳定、分散性良好的1mmol/l球形银纳米粒溶液。

3.银纳米粒固定化固相微萃取整体柱的制备：固定化银纳米粒前，先用乙腈冲洗基质整体柱，利用微泵将1ml银纳米粒溶液通入基质整体柱，然后整体柱两端封闭并浸于70℃水浴中恒温加热2h。完成后，以乙腈为流动相，在液相色谱泵上冲洗该整体柱约1h，即得到银纳米粒固定化固相微萃取整体柱。

步骤二、管内固相微萃取-高效液相色谱（in-tubespme-hplc）联用系统的构建：

所述的管内固相微萃取-高效液相色谱联用系统由微萃取和分析两部分组成，结构如附图1所示。微萃取部分包括：一个六通阀（v1）、一台液相色谱输液泵（泵a）、0.5mlpeek管定量环。分析部分包括：一台液相色谱输液泵（泵b）、一个六通阀（v2）、银纳米粒固定化固相微萃取整体柱、氨基分析柱、二极管阵列检测器。

步骤三、不饱和脂肪酸固相微萃取：

1.首先，六通阀v1和v2都在load位置。装载液通过泵a平衡银纳米粒固定化固相微萃取整体柱，流速为0.1ml/min。流动相通过泵b直接经分析柱以获得色谱分离要求的稳定基线，流速为1.0ml/min。同时，通过进样针将样品溶液注满定量环。

2.当六通阀v1调至inject位置，固相微萃取开始，定量环中的样品经由装载液带入固相微萃取整体柱，经过5min，六通阀v1调回load位置，装载液继续冲洗固相微萃取整体柱90s以消除残留的样品溶液，降低其干扰。

3.然后，泵b流速设置为0.1ml/min，六通阀v2调节至inject位置，利用流动相将固相微萃取整体柱上富集的分析对象顺序洗脱。当洗脱完成时，六通阀v2调节至load位置，设置泵b流速为1.0ml/min进行分析检测。

所述的装载液组成为正己烷/异丙醇=95%/5%(v/v)；所述的流动相为正己烷；所述的分析柱为氨基色谱柱，柱温箱温度为30℃，检测波长为203nm。

应用实施例1

按上述具体实施方式所述制备粘多糖功能化整体柱（a）和银纳米粒固定化固相微萃取整体柱（b），并以这两种整体柱作为固相微萃取整体柱，结合管内固相微萃取-高效液相色谱(in-tubespme-hplc)联用系统，考察两种油酸甲酯顺反异构体（顺-9-十八碳烯酸甲酯、反-9-十八碳烯酸甲酯）的固相微萃取行为（图2）。

具体分离条件：装载液组成：正己烷/异丙醇=95%/5%(v/v)；样品溶剂：100%正己烷；进样流速：0.1ml/min；进样体积：500μl；洗脱液组成：100%正己烷；洗脱流速：0.1ml/min；洗脱体积：150μl；分离流动相：100%正己烷；分离流速：1.0ml/min；柱温箱温度：30℃；检测波长：203nm。图2中b曲线，检测峰1是反-9-十八碳烯酸甲酯，检测峰2是顺-9-十八碳烯酸甲酯。

如图2所示，使用粘多糖功能化整体柱作为固相微萃取整体柱（曲线a）时，检测峰强度较低，且两种油酸甲酯顺反异构体无法得到分离；而使用银纳米粒固定化整体柱作为固相微萃取整体柱（曲线b）时，检测峰强度得到增强，且两种油酸甲酯顺反异构体得到分离。以上结果表明基于粘多糖功能化整体柱的固相微萃取方法，无法实现两种油酸甲酯顺反异构体的富集和顺序洗脱；而在相同实验条件下，基于银纳米粒固定化整体柱的固相微萃取方法，不仅实现了两种油酸甲酯顺反异构体的富集，并且由于顺-9-十八碳烯酸甲酯与银纳米粒的作用力强于反-9-十八碳烯酸甲酯，两种油酸甲酯顺反异构体按照作用力强度也实现顺序洗脱，并得以有效分离分析。

应用实施例2

按上述具体实施方式所述制备粘多糖功能化整体柱（a）和银纳米粒固定化固相微萃取整体柱（b），并以这两种整体柱作为固相微萃取整体柱，结合管内固相微萃取-高效液相色谱(in-tubespme-hplc)联用系统，考察亚油酸甲酯四种顺反异构体混合物（反-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯、顺-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯、反-9,顺-12-十八碳二烯酸甲酯、顺-9,顺-12-十八碳二烯酸甲酯）的固相微萃取行为（图3）。

具体分离条件：装载液组成：正己烷/异丙醇=95%/5%(v/v)；样品溶剂：100%正己烷；进样流速：0.1ml/min；进样体积：500μl；洗脱液组成：100%正己烷；洗脱流速：0.1ml/min；洗脱体积：150μl；分离流动相：100%正己烷；分离流速：1.0ml/min；柱温箱温度：30℃；检测波长：203nm。图3中b曲线，检测峰1是反-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯，检测峰2、3分别是顺-9,反-12-十八碳二烯酸甲酯、反-9,顺-12-十八碳二烯酸甲酯，检测峰4是顺-9,顺-12-十八碳二烯酸甲酯。

如图3所示，使用粘多糖功能化整体柱作为固相微萃取整体柱（曲线a）时，检测峰强度较低，且亚油酸甲酯四种顺反异构体无法得到分离；而使用银纳米粒固定化整体柱作为固相微萃取整体柱（曲线b）时，检测峰强度得到增强，且亚油酸甲酯四种顺反异构体得到分离。以上结果表明基于粘多糖功能化整体柱的固相微萃取方法，无法实现亚油酸甲酯四种顺反异构体的富集和顺序洗脱；而在相同实验条件下，基于银纳米粒固定化整体柱的固相微萃取方法，不仅实现了亚油酸甲酯四种顺反异构体的富集，并且由于亚油酸甲酯四种顺反异构体与银纳米粒的作用力不同，碳碳双键的顺式结构作用力强于反式结构，亚油酸甲酯四种顺反异构体按照作用力强度实现顺序洗脱，并得以有效分离分析。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。