专利名称：一种生产多不饱和脂肪酸的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种黑曲霉菌株利用马铃薯生产多不饱和脂肪酸的方法。
背景技术：
黑曲霉A/sジ属于真菌中的ー个常见种，广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壌中，因其所产酶类丰富，所以在エ业应用中是最常见的菌种之一。真菌中含有多种多不饱和脂肪酸，是花生四烯酸(ARA)、Y-亚麻酸(GLA)、亚油酸(LA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十ニ碳六烯酸(DHA)等脂肪酸的重要来源。多不饱和脂肪酸(PUFAs)可以调节人体的脂质代谢，在抗过敏、抗炎症，降低心血管疾病的发病率，辅助改善记忆、辅助儿童智力发育，延缓衰老等方面具有重要的生理作用。目前商业上多不饱和脂肪酸尤其是《_3多不饱和脂肪酸主要从深海鱼油中提取，高等植物和动物中很少含有w-3多不饱和脂肪酸，其生产エ艺复杂、成本高、稳定性差，还受到气候条件和资源的限制。而微生物中含量最丰富，主要以油脂和膜脂的形式存在，并且微生物具有适应性强、生长繁殖迅速、生长周期短、易培养、不受原料产地限制等特点。因此，利用微生物生产多不饱和脂肪酸是一条重要途径，寻求高产菌株和研究发酵エ艺，及新碳源的选择及廉价资源的应用正成为研究方向。世界马铃薯常年栽培面积1800万t，平均单产鲜薯15t/hmz。1999年世界马铃薯产量已达到28978万 t。马铃薯加工在带动整个马铃薯产业链良性发展方面起着重要的作用。作为实现粮食增值的主要途径之一的马铃薯加工业发展已进入高潮，目前马铃薯基本用于鲜食或加工成粉丝、粉条及淀粉，属于初级加工阶段，其增值幅度有限。
发明内容
本发明的目的在于克服上述问题而提供的一种获得的不饱和脂肪酸含量高，培养基质容易获得，发酵条件稳定、エ艺简单的生产多不饱和脂肪酸的方法。一种生产多不饱和脂肪酸的方法，包括
(1)菌种活化
将黑曲霉(Aspergillus niger xj )菌株接于PDA固体斜面培养基上，27°C静置培养3天，活化3次，保存于4°C冰箱备用；
(2)孢子悬液的制备
将活化好的菌株，用含0.05%吐温80无菌水洗下孢子，转入带有玻璃珠的100 mL无菌水中，搅拌后再在旋涡震荡器上震荡，充分打散孢子，用4层无菌镜头纸过滤除去菌丝，制成均一孢子悬液；
(3)种子液的制备将孢子悬液，以体积比5%接种量接种于IOOmLPDA液体种子培养基中，27°C，150rpm,摇瓶培养3天，得种子液；
(4)发酵培养
取种子液按体积比5%接种于13L PDA发酵培养基中，28±1° C，搅拌速度200_300rpm，通气量控制在l_2L/min，培养5天終止发酵，4层无菌纱布过滤除去菌丝体，收集发酵液，即得。上述的生产多不饱和脂肪酸的方法，其中PDA固体斜面培养基的制备方法如下马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，琼脂20g，水补足lOOOmL，pH自然。灭菌条件121°C,30min。上述的生产多不饱和脂肪酸的方法，其中PDA液体种子培养基的制备方法如下马铃薯20(^切块，用水煮沸301^11，过滤取汁，加葡萄糖2(^，水补足1000111し？11自然。灭菌条件121°C，30min。上述的生产多不饱和脂肪酸的方法，其中PDA发酵培养基的制备方法如下马铃薯2600g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖260g，水补足13000mL，pH自然，121 °C，灭菌30min。该菌种已于2005年3月7日保藏在中国典型培养物保藏中心(地址中国武汉武汉大学)，保藏号CCTCC NO M 206021，名称为黑曲霉Usperぬ7A/s niger xj)。本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知利用产多不饱和脂肪酸黑曲霉Xj对以马铃薯为主的培养基进行生物降解与转化，发酵生产多不饱和脂肪酸，可为解决多不饱和脂肪酸来源及马铃薯加工产业发展的制约因素提供一条新途径。且黑曲霉(Aspergi/A/sxj)菌株来源可靠,对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，容易培养和保存，产不饱和脂肪酸的条件稳定，可作为提取不饱和脂肪酸的菌株，扩充资源库。培养体系中用的马铃薯，资源丰富，来源可靠、安全。该技术路线合理，可大规模エ业化生产。
具体实施例方式一种生产多不饱和脂肪酸的方法，包括以下步骤
D菌种活化
将黑曲霉niger xj)菌株接于PDA固体斜面培养基(马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，琼脂20g，水补足lOOOmL，pH自然，121°C，灭菌30min)上，27°C静置培养3天，活化3次，保存于4°C冰箱备用；
2)孢子悬液的制备
将活化好的菌株，用含0. 05%吐温80 (Toween-80)无菌水洗下孢子，转入带有玻璃珠的装有100 mL无菌水的250 mL三角瓶中，用玻棒搅拌后再在旋涡震荡器上震荡，充分打散孢子，用4层无菌镜头纸过滤除去菌丝，制成均一孢子悬液；
3)种子液的制备
将孢子悬液，以5% (v/v)接种量接种于装有IOOmLPDA液体种子培养基(马铃薯200g切块，用水煮沸30min,过滤取汁,加葡萄糖20g,水补足lOOOmL,pH自然，121°C,灭菌30min)的500mL三角瓶中，27°C，150rpm,摇瓶培养3天
4)发酵培养
取种子液5% (v/v)接种于装有13L PDA发酵培养基(马铃薯2600g切块，用水煮沸30min,过滤取汁,加葡萄糖260g，水补足13000mL,pH自然，121°C，灭菌30min)的19L发酵罐中，28± 1° C，搅拌速度200-300rpm，通气量控制在l_2L/min，培养5天终止发酵，4层无菌纱布过滤除去菌丝体，收集发酵液，即得。黑曲霉(Aspergillus niger xj)发酵液中多不饱和脂肪酸的鉴定
(I)浸膏的制备
取上述所得发酵液，用石油醚萃取，减压回收溶剂，得到供试样品石油醚部分和水部分，并将石油醚部分旋蒸浓缩得到浸膏。2)样品的分离
取石油醚萃取物进行硅胶柱层析，用V(石油醚)V (こ酸こ酷)=1:0-8:1进行洗脱，得到油状物质，经TLC (薄层层析法)分析，为脂肪酸类成分。3)样品的甲酯化 取54mg油状物质于锥形瓶中，加入20ml苯-石油醚(1: 1，v/v)溶解，再加0. 2mol/lKOH-MeOH溶液10ml，振荡均匀，在40°C水浴中恒温30min，冷却，加入20ml蒸馏水，摇匀，静置，待分层清晰后取上清液减压回收溶剂，得到甲酯化产物。(4) GC-MS 分析条件
气相色谱条件HP-5MS (0. 25mmX30m, 0. 25 u m);柱温 50°C (保留 2min)，升温至 280°C(5°C /min)，保持3min ;汽化室温度为250°C ;以高纯氦为载气；柱前压7. 62psi，载气流量1. OmL/min ;进样量 IuL ;分流比 50 :1。质谱条件离子源为EI源；接ロ温度280°C ;离子源温度230°C ;倍增器电压1785V ;四极杆温度150°C ;电子能量70eV ;发射电流34. 6 y A ;质量范围10 550amu ;溶剂延迟 3min。(5)结论发酵液中的脂肪酸成分主要为亚油酸、10-十八碳烯酸、14-甲基十五烷酸和棕榈酸，其中十八碳烯酸含量最高，含量为48. 112%，其次是亚油酸，含量为41.919%，不饱和脂肪酸占90. 031%。
权利要求
1.一种生产多不饱和脂肪酸的方法，包括 (1)菌种活化 将黑曲霉Xj菌株接于PDA固体斜面培养基上，27°C静置培养3天，活化3次，保存于4°C冰箱备用； (2)孢子悬液的制备 将活化好的菌株，用含O. 05%吐温80无菌水洗下孢子，转入带有玻璃珠的100 mL无菌水中，搅拌后再在旋涡震荡器上震荡，充分打散孢子，用4层无菌镜头纸过滤除去菌丝，制成均一孢子悬液； (3)种子液的制备 将孢子悬液，以体积比5%接种量接种于IOOmLPDA液体种子培养基中，27°C，150rpm,摇瓶培养3天，得种子液； (4)发酵培养 取种子液按体积比5%接种于13L PDA发酵培养基中，28 ±1° C，搅拌速度200_300rpm，通气量控制在l_2L/min，培养5天终止发酵，4层无菌纱布过滤除去菌丝体，收集发酵液，即得。
2.如权利要求1所述的生产多不饱和脂肪酸的方法，其中PDA固体斜面培养基的制备方法如下马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，琼脂20g，水补足IOOOmL, pH 自然；灭菌条件121°C，30min。
3.如权利要求1或2所述的生产多不饱和脂肪酸的方法，其中PDA液体种子培养基的制备方法如下马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，水补足IOOOmL, pH 自然；灭菌条件121°C，30min。
4.如权利要求3所述的生产多不饱和脂肪酸的方法，其中PDA发酵培养基的制备方法如下马铃薯2600g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖260g，水补足13000mL，pH自然，121。。，灭菌 30min。
全文摘要
本发明公开了一种黑曲霉菌株利用马铃薯产多不饱和脂肪酸的方法，包括将黑曲霉xj菌株接种于PDA固体斜面培养基上，27℃培养3天，活化3次，再接入PDA液体种子培养基中，27℃，150rpm，摇瓶培养3天，得种子液，以5%(v/v)的比例将种子液转接到13LPDA发酵培养基中，28±1°C，搅拌速度200-300rpm，通气量控制在1-2L/min，培养5天终止发酵。4层无菌纱布过滤除去菌丝体，收集发酵液，即得。本方法获得的不饱和脂肪酸含量高，培养基质容易获得，发酵条件稳定、工艺简单。
文档编号C12R1/685GK103031350SQ201210136580
公开日2013年4月10日 申请日期2012年5月6日 优先权日2012年5月6日
发明者李祝, 陈青, 周礼红, 王嫱, 刘吴娟, 冯焕鹏 申请人:贵州大学