一种检测结合态杂环胺含量的方法与流程

本发明属于食品加工
技术领域：
，具体涉及一种检测结合态杂环胺含量的方法。
背景技术：
：杂环胺(heterocyclicamines,has)是在高温烹调肉、鱼等富含动物源蛋白原料过程中，由于组织中蛋白质、氨基酸、肌酸酐和肌酸发生热分解，由碳、氮、氢组成的一类具有致癌、致突变多环芳香族化合物。研究表明，长期摄入含has的肉制品可显著提高人类患癌风险。因此，has的研究已成为食品安全界的关注热点之一。迄今为止，已从高温肉制品中鉴定、分离并采用ames/salmonella实验验证具有致癌致突变性的has30余种。根据其结构与生成途径，可主要分为两大类：氨基咪唑氮杂芳烃类(aminoimidazoazarenes,aias)和氨基咔啉类(carbolines)。aias主要包括：喹啉类、吡啶类和喹喔啉类，由葡萄糖、游离氨基酸、肌酸和肌酸酐在300℃以下经热反应生成，其结构中均含有咪唑环，α位上的氨基可在体内转化为具有致癌、致突变性的n-羟基化合物。同时aias也可称为iq型杂环胺或极性杂环胺。氨基咔啉类杂环胺主要包括：α-咔啉、β-咔啉、γ-咔啉和δ-咔啉，由蛋白质或氨基酸在高于300℃时热解产生，其致癌、致突变活性与iq型杂环胺相比较弱，也可称为非iq型杂环胺或非极性杂环胺。其中aαc、meaαc两种α-咔啉类杂环胺被国际癌症研究机构(iarc)定义为潜在致癌物。结合态杂环胺是指杂环胺与蛋白质相结合形成的加合物。我国是肉制品生产、加工与消费大国，主要产品有烤牛肉饼、烤羊肉串、烤肠等。杂环胺类物质普遍存在于日常市售烧烤制品中，其中结合态杂环胺总量最高可达到微克级别。因此，有效检测肉制品中结合态杂环胺的含量具有非常重要的意义，让人们对烧烤牛肉及其制品对人类健康造成的潜在危害有了更进一步的认识。技术实现要素：本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。鉴于上述和/或现有检测结合态杂环胺的技术空白，提出了本发明。因此，本发明目的是提供一种检测结合态杂环胺含量的方法。为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种检测结合态杂环胺含量的方法，包括，对样品进行前处理；采用液相色谱质谱联用仪进行检测；所述液相色谱条件为，色谱柱是以嵌入极性基团的十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱；柱温为30～50℃；流动相中有机相包括乙腈，水相包括乙酸铵；流速为0.2～0.5ml/min；进样量为5～20μl；所述质谱条件为，离子源温度为100～120℃；脱溶剂气温度为350～450℃；毛细管电压为3.0～4.0kv；锥孔气流量为40～60l/h；脱溶剂气流量为600～800l/h；碰撞气流量为0.1～0.2ml/min；扫描范围为2～2000da。作为本发明所述检测结合态杂环胺含量的方法的一种优选方案，其中：所述液相色谱条件，其洗脱梯度包括0～0.1min为4％有机相，0.1～18min为40％有机相，18～20min为70％有机相；20～22min为100％有机相；22～22.1min为4％有机相。作为本发明所述检测结合态杂环胺含量的方法的一种优选方案，其中：所述乙酸铵为2～4mmol/l的乙酸铵，其ph＝4.75。作为本发明所述检测结合态杂环胺含量的方法的一种优选方案，其中：所述有机相为100％乙腈。作为本发明所述检测结合态杂环胺含量的方法的一种优选方案，其中：所述质谱条件，其离子化方式包括电喷雾正离子模式二级质谱。作为本发明所述检测结合态杂环胺含量的方法的一种优选方案，其中：所述对样品进行前处理，其是向样品粉末中添加氢氧化钠溶液，混匀后加入硅藻土搅拌，再加入乙酸乙酯超声萃取，收集滤渣；装入耐压瓶内，加入盐酸，混匀后水解，活化固相萃取柱后上样洗脱，氮吹后复溶，过滤，得到处理好的样品。作为本发明所述检测结合态杂环胺含量的方法的一种优选方案，其中：所述氢氧化钠，其是1～3mol/l的氢氧化钠。作为本发明所述检测结合态杂环胺含量的方法的一种优选方案，其中：所述活化固相萃取柱，其是采用色谱甲醇、超纯水、乙酸乙酯对固相萃取小柱进行活化。作为本发明所述检测结合态杂环胺含量的方法的一种优选方案，其中：所述混匀后水解，其是用氮气鼓吹2～4min，于100～120℃水解20～28h。作为本发明所述检测结合态杂环胺含量的方法的一种优选方案，其中：所述上样洗脱，其是固相萃取活化后，将水解液上样，每组上样之前于中和水解液，随后分别用盐酸和甲醇淋洗萃取柱，最后采用氨水甲醇混合液对柱填料中的杂环胺进行洗脱。本发明所具有的有益效果：(1)我方发明提供的结合态杂环胺含量的方法，提供了17种杂环胺的定性与定量特征离子及优化的质谱参数，能够同时检测17种极性、非极性的杂环胺，且回收率十分优秀。(2)我方发明提供的结合态杂环胺含量的方法，精度高，速度快，具有广泛的应用前景。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：图1是实施例1中的牛肉饼样品中杂环胺色谱图；图2是实施例2中的牛肉饼样品中杂环胺色谱图；图3是实施例3中的牛肉饼样品中杂环胺色谱图；图4是实施例4中的牛肉饼样品中杂环胺色谱图；图5是实施例5中的牛肉饼样品中杂环胺色谱图。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。实施例1游离态has的提取：准确称取4g牛肉饼(牛肉饼烘烤温度为150℃)粉末于大试管中，添加30ml1mol/l氢氧化钠溶液与之混合，采用新型t18高速分散机分散混匀1min，将处理好的肉糜转移至150ml三角瓶中，加入15g硅藻土，搅拌混匀，添加50ml乙酸乙酯超声萃取30min，重复进行两次萃取，收集上清液备用。为了充分收集乙酸乙酯萃取液，避免杂环胺提取损失，将滤渣进一步抽滤，抽滤液与上一步的上清液混合，用分液漏斗分液，收集杂环胺乙酸乙酯萃取液，在通风厨内挥发至15ml左右，待上样。下一步进行固相萃取小柱活化：分别采用6ml色谱甲醇、6ml超纯水、6ml乙酸乙酯对watersoasismcx固相萃取小柱进行活化，随后将乙酸乙酯萃取液上样，上样之前于每组萃取液中添加1ml2mol/l盐酸，充分中和萃取液中残留的氢氧化钠溶液，随后分别用6ml0.1mol/l盐酸和6ml甲醇淋洗小柱，最后采用6ml氨化甲醇(甲醇:氨水＝19:1)对小柱填料中的杂环胺进行洗脱。采用氮吹仪将收集的杂环胺洗脱液吹干，并用500μl色谱甲醇复溶，之后采用0.22μm有机针头式滤器过滤。提取得到游离态杂环胺。结合态has的提取：准确称取4g牛肉饼粉末于大试管中，添加30ml1mol/l氢氧化钠溶液与之混合，采用新型t18高速分散机分散混匀1min，将处理好的肉糜转移至150ml三角瓶中，加入15g硅藻土，搅拌混匀，添加50ml乙酸乙酯超声萃取30min，重复进行两次萃取，收集滤渣。装入耐压瓶内，加入40ml6mol/l的盐酸，并用氮气鼓吹2min，于110℃水解24h。水解液用超纯水定容至250ml，取10ml过固相萃取柱，采用氮吹仪将收集的杂环胺洗脱液吹干，并用500μl色谱甲醇复溶，之后采用0.22μm有机针头式滤器过滤。提取得到结合态杂环胺。液质联用检测：仪器：acquityuplctqd超高效液相色谱串联三重四极杆质谱联用仪色谱柱：cortecsihc18+(2.1mm*150mm,1.6μm)；柱温：45℃；流动相：a相为100％乙腈，b相为3mmol/l乙酸铵(ph＝4.75)；洗脱梯度：0～0.1min为4％a，0.1～18min为40％a，18～20min为70％a；20～22min为100％a；22～22.1min为4％a(a相为有机相，b相为水相)；流速：0.3ml/min；样品室温度：4℃；柱温：45℃；进样量：5μl。质谱条件：选择多反应监测技术(multireactionmonitoring,mrm)；离子化方式：电喷雾(esi)正离子模式二级质谱；离子源温度：110℃；脱溶剂气温度：400℃；毛细管电压：3.5kv；锥孔气流量(氮气)：50l/h；脱溶剂气流量(氮气)：700l/h；碰撞气流量(氩气)：0.13ml/min；扫描范围：2～2000da。检测结果见说明书附图1。且17种杂环胺的定性与定量特征离子及优化的质谱参数见下表。另外，uplc-ms/ms定性定量分析4种杂环胺的线性范围、相关系数、检测限、定量限、精密度和回收率见下表。实施例2游离态has的提取：准确称取4g牛肉饼(牛肉饼烘烤温度为175℃)粉末于大试管中，添加30ml1mol/l氢氧化钠溶液与之混合，采用新型t18高速分散机分散混匀1min，将处理好的肉糜转移至150ml三角瓶中，加入15g硅藻土，搅拌混匀，添加50ml乙酸乙酯超声萃取30min，重复进行两次萃取，收集上清液备用。为了充分收集乙酸乙酯萃取液，避免杂环胺提取损失，将滤渣进一步抽滤，抽滤液与上一步的上清液混合，用分液漏斗分液，收集杂环胺乙酸乙酯萃取液，在通风厨内挥发至15ml左右，待上样。下一步进行固相萃取小柱活化：分别采用6ml色谱甲醇、6ml超纯水、6ml乙酸乙酯对watersoasismcx固相萃取小柱进行活化，随后将乙酸乙酯萃取液上样，上样之前于每组萃取液中添加1ml2mol/l盐酸，充分中和萃取液中残留的氢氧化钠溶液，随后分别用6ml0.1mol/l盐酸和6ml甲醇淋洗小柱，最后采用6ml氨化甲醇(甲醇:氨水＝19:1)对小柱填料中的杂环胺进行洗脱。采用氮吹仪将收集的杂环胺洗脱液吹干，并用500μl色谱甲醇复溶，之后采用0.22μm有机针头式滤器过滤。提取得到游离态杂环胺。结合态has的提取：准确称取4g牛肉饼粉末于大试管中，添加30ml1.5mol/l氢氧化钠溶液与之混合，采用新型t18高速分散机分散混匀1min，将处理好的肉糜转移至150ml三角瓶中，加入15g硅藻土，搅拌混匀，添加50ml乙酸乙酯超声萃取30min，重复进行两次萃取，收集滤渣。装入耐压瓶内，加入40ml6mol/l的盐酸，并用氮气鼓吹2min，于100℃水解28h。水解液用超纯水定容至250ml，取10ml过固相萃取柱，采用氮吹仪将收集的杂环胺洗脱液吹干，并用500μl色谱甲醇复溶，之后采用0.22μm有机针头式滤器过滤。提取得到结合态杂环胺。液质联用检测：仪器：acquityuplctqd超高效液相色谱串联三重四极杆质谱联用仪色谱柱：cortecsihc18+(2.1mm*150mm,1.6μm)；柱温：45℃；流动相：a相为100％乙腈，b相为3mmol/l乙酸铵(ph＝4.75)；洗脱梯度：0～0.1min为4％a，0.1～18min为40％a，18～20min为70％a；20～22min为100％a；22～22.1min为4％a(a相为有机相，b相为水相)；流速：0.5ml/min；样品室温度：4℃；柱温：40℃；进样量：10μl。质谱条件：选择多反应监测技术(multireactionmonitoring,mrm)；离子化方式：电喷雾(esi)正离子模式二级质谱；离子源温度：100℃；脱溶剂气温度：400℃；毛细管电压：4.0kv；锥孔气流量(氮气)：50l/h；脱溶剂气流量(氮气)：750l/h；碰撞气流量(氩气)：0.13ml/min；扫描范围：2～2000da。检测结果见说明书附图2。实施例3游离态has的提取：准确称取4g牛肉饼(牛肉饼烘烤温度为200℃)粉末于大试管中，添加30ml1mol/l氢氧化钠溶液与之混合，采用新型t18高速分散机分散混匀1min，将处理好的肉糜转移至150ml三角瓶中，加入15g硅藻土，搅拌混匀，添加50ml乙酸乙酯超声萃取30min，重复进行两次萃取，收集上清液备用。为了充分收集乙酸乙酯萃取液，避免杂环胺提取损失，将滤渣进一步抽滤，抽滤液与上一步的上清液混合，用分液漏斗分液，收集杂环胺乙酸乙酯萃取液，在通风厨内挥发至15ml左右，待上样。下一步进行固相萃取小柱活化：分别采用6ml色谱甲醇、6ml超纯水、6ml乙酸乙酯对watersoasismcx固相萃取小柱进行活化，随后将乙酸乙酯萃取液上样，上样之前于每组萃取液中添加1ml2mol/l盐酸，充分中和萃取液中残留的氢氧化钠溶液，随后分别用6ml0.1mol/l盐酸和6ml甲醇淋洗小柱，最后采用6ml氨化甲醇(甲醇:氨水＝19:1)对小柱填料中的杂环胺进行洗脱。采用氮吹仪将收集的杂环胺洗脱液吹干，并用500μl色谱甲醇复溶，之后采用0.22μm有机针头式滤器过滤。提取得到游离态杂环胺。结合态has的提取：准确称取4g牛肉饼粉末于大试管中，添加30ml1mol/l氢氧化钠溶液与之混合，采用新型t18高速分散机分散混匀1min，将处理好的肉糜转移至150ml三角瓶中，加入15g硅藻土，搅拌混匀，添加50ml乙酸乙酯超声萃取30min，重复进行两次萃取，收集滤渣。装入耐压瓶内，加入40ml6mol/l的盐酸，并用氮气鼓吹2min，于120℃水解20h。水解液用超纯水定容至250ml，取10ml过固相萃取柱，采用氮吹仪将收集的杂环胺洗脱液吹干，并用500μl色谱甲醇复溶，之后采用0.22μm有机针头式滤器过滤。提取得到结合态杂环胺。液质联用检测：仪器：acquityuplctqd超高效液相色谱串联三重四极杆质谱联用仪色谱柱：cortecsihc18+(2.1mm*150mm,1.6μm)；柱温：45℃；流动相：a相为100％乙腈，b相为3mmol/l乙酸铵(ph＝4.75)；洗脱梯度：0～0.1min为4％a，0.1～18min为40％a，18～20min为70％a；20～22min为100％a；22～22.1min为4％a(a相为有机相，b相为水相)；流速：0.2ml/min；样品室温度：4℃；柱温：40℃；进样量：5μl。质谱条件：选择多反应监测技术(multireactionmonitoring,mrm)；离子化方式：电喷雾(esi)正离子模式二级质谱；离子源温度：110℃；脱溶剂气温度：350℃；毛细管电压：3.5kv；锥孔气流量(氮气)：45l/h；脱溶剂气流量(氮气)：700l/h；碰撞气流量(氩气)：0.13ml/min；扫描范围：2～2000da。检测结果见说明书附图3。实施例4游离态has的提取：准确称取4g牛肉饼(牛肉饼烘烤温度为225℃)粉末于大试管中，添加30ml1mol/l氢氧化钠溶液与之混合，采用新型t18高速分散机分散混匀1min，将处理好的肉糜转移至150ml三角瓶中，加入15g硅藻土，搅拌混匀，添加50ml乙酸乙酯超声萃取30min，重复进行两次萃取，收集上清液备用。为了充分收集乙酸乙酯萃取液，避免杂环胺提取损失，将滤渣进一步抽滤，抽滤液与上一步的上清液混合，用分液漏斗分液，收集杂环胺乙酸乙酯萃取液，在通风厨内挥发至15ml左右，待上样。下一步进行固相萃取小柱活化：分别采用6ml色谱甲醇、6ml超纯水、6ml乙酸乙酯对watersoasismcx固相萃取小柱进行活化，随后将乙酸乙酯萃取液上样，上样之前于每组萃取液中添加1ml2mol/l盐酸，充分中和萃取液中残留的氢氧化钠溶液，随后分别用6ml0.1mol/l盐酸和6ml甲醇淋洗小柱，最后采用6ml氨化甲醇(甲醇:氨水＝19:1)对小柱填料中的杂环胺进行洗脱。采用氮吹仪将收集的杂环胺洗脱液吹干，并用500μl色谱甲醇复溶，之后采用0.22μm有机针头式滤器过滤。提取得到游离态杂环胺。结合态has的提取：准确称取4g牛肉饼粉末于大试管中，添加30ml1mol/l氢氧化钠溶液与之混合，采用新型t18高速分散机分散混匀1min，将处理好的肉糜转移至150ml三角瓶中，加入15g硅藻土，搅拌混匀，添加50ml乙酸乙酯超声萃取30min，重复进行两次萃取，收集滤渣。装入耐压瓶内，加入40ml6mol/l的盐酸，并用氮气鼓吹2min，于110℃水解24h。水解液用超纯水定容至250ml，取10ml过固相萃取柱，采用氮吹仪将收集的杂环胺洗脱液吹干，并用500μl色谱甲醇复溶，之后采用0.22μm有机针头式滤器过滤。提取得到结合态杂环胺。液质联用检测：仪器：acquityuplctqd超高效液相色谱串联三重四极杆质谱联用仪色谱柱：cortecsihc18+(2.1mm*150mm,1.6μm)；柱温：45℃；流动相：a相为100％乙腈，b相为3mmol/l乙酸铵(ph＝4.75)；洗脱梯度：0～0.1min为4％a，0.1～18min为40％a，18～20min为70％a；20～22min为100％a；22～22.1min为4％a(a相为有机相，b相为水相)；流速：0.3ml/min；样品室温度：4℃；柱温：45℃；进样量：5μl。质谱条件：选择多反应监测技术(multireactionmonitoring,mrm)；离子化方式：电喷雾(esi)正离子模式二级质谱；离子源温度：110℃；脱溶剂气温度：400℃；毛细管电压：3.5kv；锥孔气流量(氮气)：50l/h；脱溶剂气流量(氮气)：700l/h；碰撞气流量(氩气)：0.13ml/min；扫描范围：2～2000da。检测结果见说明书附图4。实施例5游离态has的提取：准确称取4g牛肉饼(牛肉饼烘烤温度为250℃)粉末于大试管中，添加30ml1mol/l氢氧化钠溶液与之混合，采用新型t18高速分散机分散混匀1min，将处理好的肉糜转移至150ml三角瓶中，加入15g硅藻土，搅拌混匀，添加50ml乙酸乙酯超声萃取30min，重复进行两次萃取，收集上清液备用。为了充分收集乙酸乙酯萃取液，避免杂环胺提取损失，将滤渣进一步抽滤，抽滤液与上一步的上清液混合，用分液漏斗分液，收集杂环胺乙酸乙酯萃取液，在通风厨内挥发至15ml左右，待上样。下一步进行固相萃取小柱活化：分别采用6ml色谱甲醇、6ml超纯水、6ml乙酸乙酯对watersoasismcx固相萃取小柱进行活化，随后将乙酸乙酯萃取液上样，上样之前于每组萃取液中添加1ml2mol/l盐酸，充分中和萃取液中残留的氢氧化钠溶液，随后分别用6ml0.1mol/l盐酸和6ml甲醇淋洗小柱，最后采用6ml氨化甲醇(甲醇:氨水＝19:1)对小柱填料中的杂环胺进行洗脱。采用氮吹仪将收集的杂环胺洗脱液吹干，并用500μl色谱甲醇复溶，之后采用0.22μm有机针头式滤器过滤。提取得到游离态杂环胺。结合态has的提取：准确称取4g牛肉饼粉末于大试管中，添加30ml1mol/l氢氧化钠溶液与之混合，采用新型t18高速分散机分散混匀1min，将处理好的肉糜转移至150ml三角瓶中，加入15g硅藻土，搅拌混匀，添加50ml乙酸乙酯超声萃取30min，重复进行两次萃取，收集滤渣。装入耐压瓶内，加入40ml6mol/l的盐酸，并用氮气鼓吹2min，于110℃水解24h。水解液用超纯水定容至250ml，取10ml过固相萃取柱，采用氮吹仪将收集的杂环胺洗脱液吹干，并用500μl色谱甲醇复溶，之后采用0.22μm有机针头式滤器过滤。提取得到结合态杂环胺。液质联用检测：仪器：acquityuplctqd超高效液相色谱串联三重四极杆质谱联用仪色谱柱：cortecsihc18+(2.1mm*150mm,1.6μm)；柱温：45℃；流动相：a相为100％乙腈，b相为3mmol/l乙酸铵(ph＝4.75)；洗脱梯度：0～0.1min为4％a，0.1～18min为40％a，18～20min为70％a；20～22min为100％a；22～22.1min为4％a(a相为有机相，b相为水相)；流速：0.3ml/min；样品室温度：4℃；柱温：45℃；进样量：5μl。质谱条件：选择多反应监测技术(multireactionmonitoring,mrm)；离子化方式：电喷雾(esi)正离子模式二级质谱；离子源温度：110℃；脱溶剂气温度：400℃；毛细管电压：3.5kv；锥孔气流量(氮气)：50l/h；脱溶剂气流量(氮气)：700l/h；碰撞气流量(氩气)：0.13ml/min；扫描范围：2～2000da。检测结果见说明书附图5。实施例6将实施例1～5测得的四种杂环胺含量整理，得下表。aαcmeaαcharmannorharman实施例1nd5.79±1.09647±12.711924.16±68.79实施例24.21±0.2012.50±1.55784.37±31.942106.97±75.96实施例34.38±0.1413.62±1.19642.96±97.301871.80±237.25实施例44.55±0.2415.59±0.62866.20±11.64776.96±72.46实施例52.91±0.4519.51±1.12400.85±25.291304.96±110.73根据上述实施例1～5中杂环胺的测定结果可知，并非所有的结合态杂环胺含量都是随温度的升高而增加，本发明方法中烤牛肉饼中结合态杂环胺的生成量具有显著差别。例如，meaαc在150℃较低的温度下生成量较少，之后，随温度的升高含量急剧增加，而norharman则呈现相反的趋势，在低温下生成量较大，随着温度升高结合态norharman含量反而降低。众所周知，肉中化学成分极其复杂，在高温加工过程中各组分之间发生的化学反应也更是复杂多变。根据上述各实施例可知，不同的杂环胺，在不同温度下的生成趋势也有所不同。由此可见，我方发明提供的结合态杂环胺含量的方法，提供了17种杂环胺的定性与定量特征离子及优化的质谱参数，能够同时检测17种极性、非极性的杂环胺，且回收率十分优秀；我方发明提供的结合态杂环胺含量的方法，精度高，速度快，具有广泛的应用前景。应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。当前第1页12