专利名称：人3型、7型腺病毒的中和抗原表位及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药工程技术领域，具体涉及人3型、7型腺病毒的中和抗原表位 及其应用。
背景技术：
腺病毒颗粒是一个二十面体的对称结构，壳体由252个壳体亚单位组成，其中位 于二十面体的12个预角的是五邻体蛋白及一条长度为10-30nm的纤维突起；另外240个非 顶角颗粒是由六邻体三聚体构成，能刺激机体产生中和抗体以及组和型特异性抗体。不同 型别腺病毒的六邻体蛋白的氨基酸序列有高达78-95%的同源性，其变化主要集中在暴露 于病毒壳体表面的高变区(Hypervariable Regions,HVRs)；而型特异性中和抗体的识别位 点就集中在这些高变区上。人腺病毒(Adenovirus)是1953年从急性呼吸道疾病病人身上分离、鉴定出来的， 是一类主要感染人呼吸道和消化道的病原体。截目前为止，人类已经发现了 6个种属52种 不同血清型的腺病毒；其中约有1/3能引起如急性呼吸道感染、流行性角膜炎、急性出血性 结膜炎、咽结膜炎、急性咽炎、膀胱炎、婴幼儿致死性肺炎等疾病；患者主要是婴幼儿及体弱 人群。在我国，5岁以下儿童急性呼吸道疾病中约有5%是由腺病毒引起的；其中，腺病毒 引起的肺炎尤为严重，是婴幼儿肺炎发病率中仅次于呼吸道合胞病毒肺炎的一种病毒性肺 炎；严重的腺病毒肺炎不仅可以引起心力衰竭、呼吸衰竭，还可以引起肺外受累，如脑炎、肝 损害、心肌炎或心肌损害等，甚至导致死亡。腺病毒流行范围广，传播速度快，近年来在多个 国家和地区爆发和流行，给人们的公共卫生安全带来了极大的威胁。在我国，引起严重呼吸 道感染的腺病毒亚型主要是3型、4型、7型。腺病毒致病的广泛性和危害的严重性使得腺病毒的防治显得十分重要，接种腺病 毒疫苗是预防腺病毒感染最有效的方法之一。但由于腺病毒产生的中和抗体只能抵抗同型 腺病毒的感染，不能预防其他型别腺病毒感染，故4、7型腺病毒疫苗产生的抗体不能够有 效地抵抗3型腺病毒感染。此外，国外使用的4、7型腺病毒疫苗是口服的活病毒疫苗，疫苗 可以在肠道产生无症状感染而达到免疫接种的效果，但经粪便排出的腺病毒疫苗株仍具有 传染的可能性。而且由于不同亚型腺病毒间基因存在同源性，同时服用两种或多种不同亚 型的腺病毒疫苗间可能进行同源重组，而产生新的、有感染性的腺病毒颗粒，带来新的感染 风险。在我国，腺病毒疫苗的临床使用还是一片空白。从我国近年来多次爆发腺病毒疫情 来看，自主研发腺病毒疫苗十分必要。若研制出一种能同时预防多型的腺病毒感染的复制 缺陷型疫苗则可以有效的解决上述问题。
发明内容
为克服上述技术缺陷，本发明的目的是提供人腺病毒的三个中和抗原表位及其相
关应用。具体来说，本发明的目的之一是提供人3型、7型腺病毒的中和抗原表位。
本发明的人3型、7型腺病毒的中和抗原表位的氨基酸序列选自如下序列SEQ ID N0:l、2、3所示的氨基酸序列；同时，允许一个或多个氨基酸的插入、缺失、替代或添加，但 需要保持其结构和活性。上述人3型、7型腺病毒的中和抗原表位的核苷酸序列选自如下序列SEQID NO 4、5、6所示的核苷酸序列；同时，允许一个或多个核苷酸的插入、缺失、替代或添加，但需要 保证该核苷酸序列表达的多肽的结构和活性与上述人3型、7型腺病毒的中和抗原表位的 氨基酸序列表达的多肽的结构和活性一致。上述氨基酸序列为SEQ ID NO :1或核苷酸序列为SEQ ID NO :4所示的中和抗原表 位是人3型腺病毒的中和抗原表位，简称为ADV3抗原表位。上述氨基酸序列为SEQ ID NO 2和3或核苷酸序列为SEQ ID NO :5和6所示的中和抗原表位是人7型腺病毒的中和抗原 表位，分别简称为ADV7-1抗原表位和ADV7-2抗原表位。本发明的目的之二是提供该三种人3型、7型腺病毒的中和抗原表位的相关应用。 应用之一是可以利用该三种人3型、7型腺病毒的中和抗原表位制备预防3型或/和7型腺 病毒感染的疫苗。上述疫苗包含该三种人3型、7型腺病毒的中和抗原表位的多肽。如果该疫苗只 含有ADV3抗原多肽，则该疫苗只能用于预防3型人腺病毒的感染。如果该疫苗由ADV7-1 抗原多肽或/和ADV7-2抗原多肽组成，则该疫苗只能用于预防7型人腺病毒的感染。如果 疫苗包含ADV3抗原多肽和ADV7-1抗原多肽，或者ADV3抗原多肽和ADV7-2抗原多肽，或者 ADV3抗原多肽、ADV7-1抗原多肽和ADV7-2抗原多肽，则该疫苗可以用于同时预防3型和7 型人腺病毒的感染。应用之二是可以利用该三种人3型、7型腺病毒的中和抗原表位制备抗体或抗原结 合片段，该抗体或抗原结合片段能特异地与相应的人3型、7型腺病毒的中和抗原表位结合。进一步，利用该抗体或抗原结合片段可以制备用于预防或治疗腺病毒感染的药 物，该药物含有上述抗体或抗原结合片段。进一步，本发明还提供了预防治疗腺病毒感染的方法，即施用免疫有效量的上述 疫苗或药物。应用之三是将该三种人3型、7型腺病毒的中和抗原表位做为靶蛋白，用于开发诊 断试剂盒。进一步，本发明提供了一种检测腺病毒感染的方法，即使用上述诊断试剂盒。本发明提供了三种人3型、7型腺病毒的中和抗原表位，利用该中和抗原表位可以 制备同时预防3型和7型腺病毒感染的二价疫苗，该重组疫苗有如下优点由于腺病毒分 子量大，因而能有效地刺激机体产生免疫反应；在六邻体蛋白中插入一个外源抗原表位，则 每个腺病毒就可以表达720个抗原表位，抗原表位得以充分表达；目的抗原肽插在六邻体 的高变区，易于暴露于病毒壳体的表面，能有效地刺激机体产生免疫反应；为研究基于3型 腺病毒载体的腺病毒_抗原表位展示重组载体系统打下基础。同时本发明提供的三种人3 型、7型腺病毒的中和抗原表位还能制备药抗体物和检测试剂盒。
图1是本发明利用生物信息学分析预测人3型、7型腺病毒的高变区的三维立体
4图。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验 方法，通常按照常规实验方法进行。实施例1 生物信息学分析预测人腺病毒的高变区(HypervariableRegions， HVRs)生物信息学分析的具体步骤如下首先进行人腺病毒六邻体蛋白氨基酸序列比 对，然后利用Emboss中的“Antigenic”工具对可能的中和抗原表位进行预测。进而对人3， 7型腺病毒六邻体的3D立体结构进行建模和对3D结构上的潜在中和表位进行绘图。最后 找到暴露于六邻体“环”表面的位点并定位于序列上的非恒定区(高变区)。图1是上述分析结果的三维立体图，A排为俯视图，B排为侧视图。通过对图1的 结果进行分析，可以对人3，7型腺病毒六邻体上的潜在中和抗原表位进行定位，并获得其 氨基酸序列。氨基酸序列具体如下所示，其中HVR1，2，5，7分别表示高变区1，2，5，7 :3 型腺病毒(ADV3)HVRl :ivttnrdnavttttntHVR2 :keglqigkditttegeekpiyadkHVR5 :dgrdavagalapeivlytenHVR7 :ikvktddangwekdan7 型腺病毒(ADV7)HVRl :ivttgednattytHVR2 :kegleigkditadnkpiyadkHVR5 :dgreaadafspeivlytenHVR7 :ikprdtawekdt实施例2 构建重组病毒为了通过血清中和试验和攻毒实验分析预测得到的3型和7型人腺病毒的高变区 (HVR)的中和抗原表位，发明人用重叠PCR(overlapping PCR)方法构建重组病毒。用重叠PCR(overlapping PCR)方法将7型腺病毒的HVR1、2、5和7序列替 换至PBR322-L-R质粒上，再与PBR-Adv3-EGFP质粒同源重组。具体得到的重组质 粒为 PBR-Adv3 (Adv7-1) -EGFP, PBR-Adv3 (Adv7_2) -EGFP, PBR-Adv3 (Adv7_5) -EGFP, PBR-Adv3(Adv7-7)-EGFP，其中，PBR_Adv3 (Adv7_l)-EGFP 表示 Adv3 的高变区 1 被 Adv7 的 高变区1所替换，其他以此类推。将上述重组得到的阳性质粒转染细胞，得到重组病毒MH1、MH2、MH5和MH7 ；其中重 组病毒MHl由重组质粒PBR-Adv3 (Adv7-1) -EGFP转染细胞得到，以此类推。实施例3 血清中和试验为了制备抗血清，进行血清中和试验。将纯化的重组病毒MH1、MH2、MH5和MH7以及 带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的野生3型ADV病毒(ADV3E)和野生7型ADV病毒(ADV7) 分别注射Balb/C小鼠腹腔。分别得到MH1、MH2、MH5和MH7以及ADV3E和ADV7的多克隆抗体，然后进行中和试验。分两组进行中和试验第一组是检测抗ADV3E和ADV7血清与重 组病毒MH1、MH2、MH5和MH7之间的中和反应，以检测重组病毒中是否包括ADV3和ADV7的 中和抗原表位；第二组是检测MH1、MH2、MH5、MH7、ADV3E、ADV7和正常对照小鼠的抗血清与 ADV3之间的中和反应，以检测重组病毒产生的抗体是否具有中和ADV3E病毒的能力。具体实验步骤如下1、细胞准备ifep-2细胞长满之后，用胰酶消化，加含10%新生牛血清DMEM培养基 稀释至96孔细胞培养板，细胞密度为每孔2X IO4个，于37°C 5% CO2培养箱培养。2、病毒准备先将各种病毒进行TCID5tl滴定，所有病毒MHl、MH2、MH5、MH7、ADV7、 ADV3E全部稀释至浓度100TCID5Q。3、血清准备用含2%新生牛血清的无酚红DMEM将抗MHl、MH2、MH5、MH7、ADV7、 ADV3E以及正常小鼠血清梯度稀释成25、27、29、2"、213、215、217。其中正常小鼠血清用作阴性 对照。4、不同病毒与不同血清相互做中和试验将稀释好的病毒与每个血清梯度各加 50 μ 1，混合均勻，放至37°C温箱孵育1小时，待细胞在细胞板中生长24小时，大约均勻铺 满60%时，吸尽细胞板中的培养基，用PBS洗两遍，加入孵育好的血清病毒。每个血清梯度 做3个平行孔，同时每块细胞板预留5孔正常细胞及5孔病毒感染细胞做对照。加好后，放 37°C 5% CO2培养箱培养。5、结果读取培养72小时后，(1)由于病毒MH1，MH2，MH5，MH7，ADV3E表达荧光蛋 白，先用荧光显微镜观察并拍照保存结果。小心将细胞板里的培养基吸出，用胰酶消化每孔 细胞，再用PBS重悬细胞，转入专用测荧光值96孔板中，485nm/518nm波长处读数，将测完 荧光值的细胞反复冻融3次之后，每孔取50 μ 1抽提核酸做定量PCR。(2)ADV7病毒的中和 试验平行做2份，一份用于中性红染色，一份用于荧光定量PCR。ADV7病毒由于不带荧光标 记，用中性红染色结果显示。先去除培养板中的培养基，加入50μ1 0.5%中性红(溶解于 PBS中)，37°C培养箱中孵育1小时，150 μ IPBS洗2次，加染色液染色，于550nm波长读数。第一组的中和反应的实验结果见表1，表1为抗ADV3E血清、抗ADV7血清、正常对 照小鼠血清和抗重组病毒血清对MH1、MH2、MH5和MH7病毒的中和实验结果。表 1
病毒种类抗血清的中和效价■抗ADV3E血清抗ADV7血清正常对照鼠血清MH1/MH2/MH5/ MH7 血 清MHl病毒>218-->218MH2病毒>216<218>26 <2S->218MH5病毒>214 <216->218MH7病毒>2" <2'4-->214 <216 表1中数据显示将ADV3的HVR7改造为ADV7的HVR7后，抗ADV3E血清对MH7的
6抑制作用出现下降，因而HVR7是ADV3的抗原中和表位。抗ADV7病毒血清对MH2和MH5病 毒感染具有抑制能力，因而HVR2和HVR5是ADV7的抗原中和表位。同时，抗ADV3E血清对 MH1、MH2、MH5病毒依然具有中和能力，表明对ADV3E的HVR1、HVR2和HVR5进行改造并未改 变ADV3E的中和位点，改造后的病毒仍然保有ADV3病毒中和表位。第二组的中和反应的实验结果见表2，表2为抗MHl病毒血清，抗MH2病毒血清， 抗MH5病毒血清，抗MH7病毒血清，抗ADV3E病毒血清，抗ADV7病毒血清，正常对照小鼠血 清对ADV3E病毒中和能力实验表 权利要求
人3型、7型腺病毒的中和抗原表位，其特征在于，所述中和抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO1、2、3所示的氨基酸序列，以及含有一个或多个氨基酸插入、缺失、替代或添加并保持其结构和活性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的人3型、7型腺病毒的中和抗原表位，其特征在于，所述中和 抗原表位的核苷酸序列如SEQ ID NO :4、5、6所示的核苷酸序列，以及含有一个或多个核苷 酸插入、缺失、替代或添加的核苷酸序列。
3.权利要求1或2所述的人3型、7型腺病毒的中和抗原表位的应用，其特征在于，用 于制备预防3型或/和7型腺病毒感染的疫苗或药物。
4.一种疫苗，其特征在于，包含权利要求1或2所述的人3型、7型腺病毒的中和抗原 表位的多肽。
5.—种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段特异地与权利要 求1或2所述的人3型、7型腺病毒的中和抗原表位结合。
6.一种药物，其特征在于，所述药物含有权利要求5所述的抗体或抗原结合片段。
7.预防治疗腺病毒感染的方法，其特征在于，施用免疫有效量的权利要求4所述的疫 苗或有效量的权利要求6所述的药物。
8.权利要求1或2所述的人3型、7型腺病毒的中和抗原表位的应用，其特征在于，做 为靶蛋白用于开发诊断试剂盒。
9.检测腺病毒感染的方法，其特征在于，使用了权利要求8所述的诊断试剂盒。
全文摘要
本发明公开了一种人腺病毒的三个中和抗原表位及其相关应用。本发明的人3型、7型腺病毒的中和抗原表位的氨基酸序列选自如SEQ ID NO1、2、3所示的氨基酸序列，其核苷酸序列选自如SEQ ID NO4、5、6所示的核苷酸序列。利用该三种人3型、7型腺病毒的中和抗原表位可制备预防3型或/和7型腺病毒感染的疫苗或抗体、抗原结合片段，进而该抗体或抗原结合片段可以制备用于预防或治疗腺病毒感染的药物，该药物含有上述抗体或抗原结合片段。本发明还提供了预防治疗腺病毒感染的方法，即施用免疫有效量的上述疫苗或药物。还可将该三种人3型、7型腺病毒的中和抗原表位做为靶蛋白，用于开发诊断试剂盒。
文档编号C07K7/08GK101942011SQ20101001944
公开日2011年1月12日 申请日期2010年1月19日 优先权日2010年1月19日
发明者周志超, 周荣, 李潇, 苏晓波, 邱红玲, 钟南山, 高文娟 申请人:呼吸疾病国家重点实验室