专利名称：融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素的重组杆状病毒及其亚单位疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS 的重组杆状病毒及重组亚单位疫苗。
背景技术：
杆状病毒表达系统是目前比较成熟的表达系统之一，具有安全无毒，外源表达量高，可以对蛋白进行翻译后修饰等优点，已经成功用于多种蛋白的生产和疫苗的制备。而 Cap蛋白是由猪圆环病毒2型PCV2的0RF2编码的大约30kD的衣壳蛋白，包含多个抗原表位和中和抗原表位，已被公认为是PCV2主要的免疫保护性抗原。国外已有用杆状病毒系统表达Cap制备的商品化疫苗上市使用，并经临床证明安全有效。生长抑素(SQ是十四个氨基酸的小肽，与下丘脑生长激素释放因子(GHRF)共同调节生长激素(GH)的释放，已有研究报道证实通过与载体蛋白融合，主动免疫动物，可使机体产生针对SS抗体，中和体内SSJ^ 除SS的抑制作用，促进动物的生长。本研究将SS与PCV2 Cap融合在杆状病毒系统中表达， 以期开发一种既可防控PCV2又能促进猪体生长的新型亚单位疫苗。
发明内容
本发明的目的是提供一种融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素的重组杆状病毒。本发明的另一目的是提供一种能够有效预防控制PCV2相关疾病的亚单位疫苗， 有效防控PCV2相关疾病。本发明的实施方案如下融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒rAc-Cap-SS，该重组杆状病毒带有猪圆环病毒2型Cap蛋白基因开放阅读框和生长抑素SS基因形成的融合基因0RF2-SS。其中，所述的融合基因0RF2-SS序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2010年12月17日，保藏号 CGMCC No. 4459的。该重组杆状病毒rAc-Cap-SS在分类上属于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒，该重组杆状病毒可以对目的蛋白进行有效的表达，表达的目的蛋白含量较高，免疫原性较好，并可形成病毒样颗粒，可用于制备新型PCV2亚单位疫苗和仔猪促生长亚单位疫
田ο本发明重组杆状病毒是通过以下方法构建而成的(1)0RF2-SS基因的扩增、克隆根据PCV2毒株SH(AY686763)的序列设计扩增Cap 蛋白基因特异性引物以及引入SS基因的引物，引物序列如下Pl :5，CTTGGATCCATGACGTATCCAAGGAG-3‘ (SEQ ID NO. 2)
PCV2SS1 :5’ -CTTCCAGAAGAAGTTCTTGCAGCCAGCCATCTTAGGGTTAAGTGGG-3’ (SEQ ID NO. 3)PCV2SS2 :5’ -ATACTCGAGTTACTAACAGGATGTGAAAGTCTTCCAGAAGAAGTTCTTGC-3' (SEQ ID NO. 4)采用常规方法提取PCV2病毒DNA，应用PCR技术分两次扩增得到引入SS基因的0RF2-SS基因片段，通过BamH I/Xho I酶切位点，将0RF2-SS基因克隆入供体质粒 pFastBac HTB中，通过PCR和酶切鉴定，阳性质粒进一步经测序鉴定，获得阳性重组质粒 pF-Cap-SS。(2)转化DHlOBac感受态大肠杆菌参照Bac-to-Bac表达系统说明书的方法将鉴定好的pF-Cap-SS转化入DHlOBac感受态大肠杆菌，在Helper质粒的辅助作用下，重组质粒pF-Cap-SS和杆状病毒骨架载体Bacmid之间发生同源重组，实现了把外源基因转入杆状病毒骨架载体，经两次蓝白菌落筛选，挑取白色菌落培养，提取重组Bacmid质粒，分别利用 M13F和PCV2SS2以及Pl和M13R进行PCR鉴定，获得含0RF2-SS基因的重组Bacmid质粒 rBac_Cap_SS。(3)重组杆状病毒的获得鉴定好的rBac-Cap-SS通过转染Sf9细胞，重组质粒在 Sf9细胞内包装成完整的重组杆状病毒rAc-Cap-SS。本发明所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS在制备猪圆环病毒2型疫苗中的应用。所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS优选保藏号为CGMCC No. 4459的重组杆状病毒。一种亚单位疫苗，含有所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS表达的PCV2Cap_SS融合蛋白BCap-SS和佐剂。所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS优选保藏号为CGMCC No. 4459的重组杆状病毒。所述的融合蛋白BCap-SS序列如SEQ ID NO. 7所示。所述的亚单位疫苗的制备方法将转染得到的Fl代重组杆状病毒rAc-Cap-SS在 Sf9细胞上扩增，获得F2/3代病毒。Western-blot试验结果表明BCap-SS蛋白稳定表达， 以接毒后7 表达量最高。将扩增得到的病毒接种Sf9细胞，27°C培养，72小时后收获细胞，PBS洗涤1次，加入PBS，冰上超声裂解细胞20min，裂解物经12000rpm，4°C，离心15min 去除细胞碎片，取上清与佐剂混合制备亚单位疫苗。有益效果本发明首次提出了用杆状病毒表达系统融合表达PCV2 Cap蛋白与生长抑素SS。试验证明，本发明构建的重组杆状病毒对外源蛋白表达稳定，而且其效价稳定。通过小鼠免疫和猪体免疫保护试验证明了表达的重组蛋白能诱导产生了针对PCV2的特异抗体，并可促进增重，在猪体可以提供对PCV2攻毒的保护力，且对人、猪等动物没有致病性， 容易通过安全性评价。生长抑素(SS)是十四个氨基酸的小肽，与下丘脑生长激素释放因子(GHRF)共同调节生长激素(GH)的释放，已有研究报道证实通过与载体蛋白融合，主动免疫动物，可使机体产生针对SS抗体，中和体内SS，解除SS的抑制作用，促进动物的生长。本研究将SS与 PCV2Cap融合在杆状病毒系统中表达，开发一种既可防控PCV2又能促进猪体生长的新型疫苗。因此在PCV2的防治方面具有广阔的应用前景。亚单位疫苗含有所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS表达的PCV2Cap_SS融合蛋白BCap-SS,能够发挥Cap蛋白和生长抑素SS的双重功效，用于免疫猪只，既能够防控PCV2又能促进猪体生长。
图lPCV2Cap-生长抑素SS基因克隆入载体示意图。图2Cap_SS基因重组质粒pF-Cap-SS酶切鉴定结果；1 =PCR 产物对照 2 :pF-Cap-SS 酶切 3 :DNA Marker DL-2000。
图 3rBac-Cap_SS 质粒的 PCR 鉴定，1 以 Pl 和 M13R 为引物扩增 Bacmid，2，3 以 Pl 和 M13R 为引物扩增 rBac-Cap-SS， 4 :1Kb DNA ladder Marker，5 以 M13F 和 PCV2SS2 为引物扩增 Bacmid，6，7 以 M13F 禾口 PCV2SS2 为引物扩增 rBac-Cap-SS。图4重组病毒产生的细胞病变(CPE)，A 正常Sf9细胞B :rAc-Cap-SS感染细胞2 :rAc_Cap感染细胞。图5重组病毒的IFA鉴定，A :rAc-Cap-SS 感染的 Sf9 细胞 B :rAc-Cap 感染的 Sf9 细胞；C 野生型杆状病毒感染的Sf9细胞D:正常Sf9细胞。图6重组蛋白表达的Wfestern blot鉴定(A 阳性猪血清；B =SS抗体)；1 :rAc-Cap-SS感染细胞裂解物 2 :rAc-Cap感染细胞裂解物 3 野毒感染细胞裂解物。图7透射电镜观察病毒样颗粒的形成(A =BCap蛋白；B =BCap-SS蛋白)。
图8小鼠免疫抗体变化规律。图9小鼠免疫增重情况。图10猪体免疫抗体变化规律。图11猪体免疫后各组RDWG变化情况。图12猪血清SS水平检测结果。图13攻毒后猪体病毒血症检测结果。图14猪肺脏、淋巴结组织病理学检测。图15猪淋巴结IHC检测结果。生物材料保藏信息融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒rAc-Cap-SS， 于2010年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC， 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.4459。猪圆环病毒2型PCV2-SH毒株，于2008年03月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 2389。
具体实施例方式实施例lPCV2CapSS基因的扩增、克隆和鉴定
1. IPCR引物设计合成根据PCV2毒株SH(AY68676;3)的序列设计扩增Cap蛋白基因特异性引物以及引入 SS基因的引物，引物由上海^witrogen公司合成。引物序列如下Pl :5，CTTGGATCCATGACGTATCCAAGGAG-3’ (SEQ ID NO. 2)PCV2SS1 :5，-CTTCCAGAAGAAGTTCTTGCAGCCAGCCATCTTAGGGTTAAGTGGG-3，(SEQID NO. 3)PCV2SS2 :5’ -ATACTCGAGTTACTAACAGGATGTGAAAGTCTTCCAGAAGAAGTTCTTGC-3' (SEQ ID NO. 4)1.2PCR扩增目的基因采用常规酚氯仿抽提法提取猪圆环病毒2型PCV2-SH毒株(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2008年3月4日，保藏号=CGMCC No. 2389) 基因组DNA，应用PCR技术分两次扩增得到引入SS基因的0RF2-SS基因片段。第一次PCR 以PCV2 SH毒株的基因组DNA为模板，以Pl和PCV2SS1为引物；第二次PCR以第一次PCR 产物为模板，以Pl和PCV2SS2为引物。PCR体系=DNA模板2. 0 μ 1，Pl 1. 0 μ 1，PCV2SS1或 PCV2SS2 1. 0μ 1,2. 5mM dNTPs 2. 0 μ 1，无Mg2+缓冲液 2. 5 μ 1，25mM Mg2+L 5 μ 1，Taq DNA 聚合酶0.5μ1，用无菌双蒸水补至总体积25.0μ1。在PCR仪上进行反应。循环参数为94°C 预变性5min ；94°C变性45s，M°C退火45s，72°C延伸45s，共进行35个循环；然后72°C延伸 IOmin0 PCR产物进行(g/ml)琼脂糖凝胶电泳。1.3PCR产物的克隆1. 3. IPCR产物回收与纯化PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切下含目的条带的琼脂糖胶块，参照 DNA快速回收纯化试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)说明书回收目的片段。1. 3. 2PCR产物酶切与纯化酶切反应总体积为20. 0μ 1 :10 Xbuffer 2. 5 μ 1，PCR 回收片段 10. 0 μ 1，BamH I/ Xho I各Ι.ΟμΙ，用无菌双蒸水补至总体积20.0μ1。37°C作用4.0h，然后进行琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。1. 3. 3pFastBac HTB 酶切与纯化酶切反应总体积为20 μ 1。IOXbuffer 2. 0 μ 1，质粒 pFastBac HTB Qnvitrogen 公司)10. 0 μ 1，BamH I/Xho I各1. 0 μ 1，用无菌双蒸水补至总体积20. 0 μ 1。37°C作用 4. Oh，用琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收，方法同上。实施例2重组质粒pF-Cap-SS的构建2. 1目的基因克隆入pFaStBaCTMHT B载体通过酶切位点BamH I/Xho I，将1. 3. 2中纯化的PCR产物与1. 3. 3中纯化的 pFastBac HTB线性大片段连接，从而将0RF2-SS基因克隆入供体质粒pFastBaCTMHTB中(示意图见图1)，转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，挑取单个菌落培养，常规的碱裂解法提取质粒。通过PCR和酶切鉴定，阳性质粒进一步经测序鉴定，获得含序列如SEQ ID NO. 1所示的 0RF2-SS基因的阳性重组质粒pF-Cap-SS。2. 2重组质粒的提取和鉴定提取后的重组质粒pF-Cap-SS采用PCR(Pl和PCV2SS2为引物)和BamH I/Xho I双酶切鉴定，结果见图2，在PCR和双酶切鉴定中都可以见到目的条带。实施例3重组Bacmid质粒rBac-Cap-SS的获得3. 1大肠杆菌DHlOBac感受态细菌的制备与转化在卡那霉素(50 μ g/ml)抗性平板上挑取一个新鲜的DHlOBac (Invitrogen)菌落接种于含50yg/ml卡那霉素的5ml LB培养基中，37°C 200rpm过夜振荡培养；第二天按 1/100体积接种于一新的含卡那霉素的LB培养基中，振荡培养。取1. 5ml菌液制备感受态细胞，方法参见分子克隆。按照Bac-to-Bac表达系统说明书进行重组质粒pF-Cap-SS 转化DHlOBac感受态细胞，在DHlOBac中Helper质粒的辅助作用下，重组质粒pF_Cap-SS 和杆状病毒骨架载体Bacmid之间发生同源重组得到含0RF2-SS基因的重组Bacmid质粒 rBac-Cap-SS，实现了把外源基因转入杆状病毒骨架载体，最终以10_\ 10_2两个梯度涂板。3. 2重组细菌的挑选和质粒提取经过4 培养，挑取平板上大的白色菌落进行第二次蓝白斑筛选，挑取二次筛选仍为白色的菌落接种于3. Oml含四环素(10 μ g/ml)、卡那霉素(50 μ g/ml)、庆大霉素(7yg/ml)的LB培养基中，过夜培养；按照说明书提供的方法提取重组Bacmid质粒 rBac-Cap-SS，溶于30 μ 1无菌双蒸水中，然后进行0. 8% (g/ml)的琼脂糖凝胶电泳。3. 3重组质粒的PCR鉴定提取的重组质粒rBac-Cap-SS 作为模板，以 Ml3F (5，-GTTTTCCCAGTCACGAC-3，， SEQID NO. 5)、PCV2SS2、P1 以及 M13R(5，-CAGGAAACAGCTATGAC-3，，SEQ ID NO. 6)进行 PCR 鉴定。25. 0μ 1的反应总体积质粒0. 5 μ 1，上、下游引物各1. 0μ 1,2. 5mM dNTPs 2. 0μ 1， 25mM Mg2+L 5 μ 1,10XMg2+free buffer 2. 5 μ 1，Taq 酶 0. 25 μ 1，加水至终体积 25. 0 μ 1。 PCR循环参数参照Bac-to-Bac表达系统说明书进行，扩增出目的条带大小约2500bp和 1400bp，结果见图3。实施例4重组杆状病毒的获得与鉴定4. 1重组质粒转染Sf9细胞转染在M孔板上进行，在转染的前一天，在M孔板上的每一孔接种5. OX IO4个 Sf9细胞，每一孔用营养液0. 5ml，营养液含10%的胎牛血清；在转染前取出_20°C保存的阳离子脂质体转染试剂I^ransFast Transfection Reagent (Promega)，使之达到室温并涡漩，如果溶液在管的上部，可以通过离心把它沉到管底；在一个灭菌的EP管中按Iyg质粒加入3 μ L转染试剂的比例加入rBac-Cap-SS和转染试剂共11 μ L (重组质粒8 μ L，转染试剂3 μ L)，然后用无血清的Grace’ s培养基补足体积至200 μ 1，室温温育混合物15min ；从温箱中取出细胞板，弃去上清；把200 μ 1混合物加入细胞孔。然后立即把细胞板放入温箱中，温育1. Oh后，轻轻加入0. 5ml室温的完全生长液，把细胞放入温箱，每天观察细胞病变。 转染同时设立野生型Bacmid转染对照，以获得野生型杆状病毒。4. 2重组病毒的获得与增殖转染后每天观察细胞病变情况，在转染后3天可以看到细胞出现变大变圆的病变表现(图4)，继续培养至第5天，收获培养上清，2000 X g，离心lOmin，将上清转移至新的灭菌离心管中，此即为第一代病毒(PI viral stock)。将第一代重组病毒rAc-Cap-SS按 1 10(重组病毒Sf9)的体积比感染处于对数生长期的Sf9细胞，27°C培养3-4d至细胞出现明显病变时，即可收获上清得到第二代病毒(P》；用同样的方法获得第三代病毒(P3)，每一代病毒均置4°C避光保存。野生杆状病毒亦用同样方法扩增保存。4. 3空斑试验测定重组病毒滴度按照Bac-to-Bac表达系统说明书的方法进行空斑试验，计算重组病毒的滴度。用营养液将重组病毒作10倍梯度稀释。然后分别接种于长满Sf9细胞单层的M孔细胞培养板，每个稀释度接种2个孔，每孔接种100 μ L。同时设定不接毒的阴性对照。27°C吸附lh， 弃去病毒液，每孔加入配制好的琼脂0. 5mL，27°C培养7-10天，中性红染色池后计算每个稀释度每孔中空斑数量。计算出病毒的滴度可达5Xl(fpfu/mL。4. 4重组病毒的IFA鉴定重组病毒rAc-Cap (本采用引物 Pl 5 ‘ -CTTGGATCCATGACGTATCCAAGGAG-3 ‘ (SEQ IDN0. 2)和 P2 5' -CTTCTCGAGTCACTTAGGGTTAAGTGGG-3‘ (SEQ ID NO. 8)扩增 Cap 全基因， 克隆入pi^ast载体，转化DHlOBac获得重组Bacmid，转染Sf9细胞得到)(李文良,王先炜， 马涛，李玉峰，姜平.PCV2SH1分离株Cap蛋白在杆状病毒中的表达与鉴定.中国兽医科学 (2010)40(11) :1156-1160.)和rAc-Cap-SS感染培养于96孔板的单层Sf9细胞，同时设野生型杆状病毒感染和正常Sf9细胞对照，细胞出现病变后，弃培养上清液，PBS洗涤细胞后用预冷的无水乙醇固定，PBS洗2次，加入1 100稀释的Cap蛋白单克隆抗体，37°C孵育 lh，PBS洗3次，加入1 200稀释的FITC-羊抗鼠IgG，37°C孵育45min，PBS洗3次，于荧光显微镜下观察，重组病毒感染细胞胞浆内有特异荧光出现，而野生型杆状病毒感染细胞和正常细胞中无特异荧光出现(图5)。4. 5ffestern blot 鉴定将扩增得到的重组杆状病毒rAc-Cap-SS接种Sf9细胞，同时设立野生型杆状病毒和重组病毒rAc-Cap对照，在感染后7 收取细胞培养物。具体操作为弃去细胞培养上清，加入预冷的0. 01mol/L pH 7. 2PBS洗涤细胞两次，加入PBS，在冰上超声裂解细胞，于 40C 12000r/min 离心 15min，吸取上清，加入 5 X Loading Buffer 煮沸处理 5min。取 15 μ L 样品进行SDS-PAGE，用考马斯亮蓝R-250染色观察。Western-blot鉴定采用PCV2阳性猪血清(VMRD，pullman，WA，USA)和商品化兔抗 SS多抗(北京博奥森生物公司)进行。SDS-PAGE电泳结束后，采用半干转印的方法将蛋白转印到硝酸纤维素膜上，10%脱脂乳室温封闭4h，分别加入1 100稀释的Cap单克隆抗体和1 200稀释的兔抗SS多抗，室温孵育2.釙，PBST洗涤3次，加入1 10000稀释的HRP 标记的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG (武汉博士德)，室温孵育1. 5h，PBST洗涤3次，加入化学发光显色液，在暗室进行X光片显影，观察特异性蛋白条带，结果见图6，由图5和图6可见重组杆状病毒rAc-Cap-SS能够对目的蛋白Cap和SS进行有效的表达。将该重组杆状病毒 rAc-Cap-SS送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，该中心地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏日期2010年12月17日，保藏号 CGMCC No. 4459。4. 5病毒样颗粒的形成将重组杆状病毒rAc-Cap-SS (CGMCC No. 4459)接种Sf9细胞，大量表达重组蛋白 BCap-SS，收获细胞裂解后4°C 12000r/min离心20min收获上清，上清60000 X g，4°C，离心 3h,沉淀用PBS重悬，铺于20-60 %蔗糖上，100000 X g，4°C，离心2h，吸取不同梯度分界面的样品，进行ffesternblot鉴定，方法同前，选取蛋白含量最高最纯的样品再次超速离心除去蔗糖，沉淀用PBS重悬，进行电镜观察，检测病毒样颗粒的形成，见图7，结果表明重组蛋白 BCap-SS可以形成病毒样颗粒。实施例5亚单位疫苗的制备和小鼠免疫试验将扩增得到的重组杆状病毒rAc-Cap和rAc_Cap_SS (CGMCC No. 4459)接种Sf9细胞，27°C培养7 收取细胞培养物。具体操作为弃去细胞培养上清，加入预冷的0. Olmol/ L pH 7. 2PBS洗涤细胞两次，加入PBS于冰上裂解细胞20min，再于4°C 12000r/min离心 15min,吸取上清，分光光度计测定蛋白浓度，-20°C保存备用。分别取上一步制备的重组蛋白Bcap (rAc-Cap分泌)，BCap-SS，按终浓度0. 5mg/mL 分别加入CP940佐剂，充分混勻，即成亚单位疫苗。取90只6周龄健康清洁级小白鼠随机分成3组，每组30只。BCap、BCap-SS、空白对照(NC)各一组，免疫剂量为0. 2mL，背部皮下多点注射，免疫2次，间隔时间2周，在1免和2免后2周采集小鼠血清做ELISA试验测定血清抗体水平，结果见图8。由图8可见一免后2周可以检出相应抗体，BCap, BCapSS免疫组抗体效价在1 200左右，2免后抗体效价迅速升高平均可达1 1600，两个免疫组无显著差异，空白对照组一直为阴性。首次免疫后第0、14、28、42和56天称量每只小鼠体重，计算每组小鼠增重情况。 结果见图9。由图9可见第14天时三组无明显差异，第28天时BCap-SS免疫组增重开始升高，第42天时BCap-SS免疫组增重继续增加，高于其余两组；第56天时，虽然还高于另两组，但已无明显差异，说明BCap-SS免疫后能够在一定时间内促进机体增重。实施例6亚单位疫苗的猪体免疫保护试验6. 1试验设计25头观日龄断奶仔猪，经PCR和RT-PCR检测PCV2和PRRSV为阴性，ELISA检测抗体阴性。随机分为5组，每组5头。第一、二组分别接种PCV2亚单位疫苗(BCap和BCap-SS， 实施例5制备)，第三组接种PCV2灭活疫苗(iPCV2，江苏南农高科技股份有限公司)，第四、 五组不接种分别作为攻毒对照(CC)和空白对照(NC)，一免后14天前三组分别加强免疫，剂量方法同第一次(表1)。 在第28天每头猪攻毒2mL (PCV2SH, 105TCID50/mL,滴鼻aiiL，每个鼻孔ImL)，攻毒后第4、7天每头猪腋下和臀部四点注射经弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(lmg/ mL)，同时腹腔注射IOmL巯基乙酸培养基，第11、19天腹腔注射IOmL巯基乙酸培养基。所有猪在攻毒后25天均剖杀，实验设计见表1。各组猪隔离饲养，免疫后观察各免疫组有无异常表现(发热、腹泻、精神不好)以及注射部位有无红肿反应。攻毒后，每天上午测量每头猪直肠温度，上下午两次观察有无异常临床表现(精神沉郁、咳嗽、呼吸困难、皮肤被毛、食欲减退)，并进行打分(0-6分)。首免后14天、观天，攻毒后7、11、19和25天分别采血，分离血清，用于抗体水平和病毒血症的检测。首免时、首免后14天、观天和剖杀时每头猪分别称重，用于计算相对日增重(RDWG =(检测时体重-初始体重)/天数/初始体重)。评价免疫后和攻毒前后各组猪体增重差异。剖杀时观察每头猪病变，取淋巴结、肺脏于10%缓冲福尔马林固定，用于组织切片制作和免疫组化实验。表1实验设计
权利要求
1.融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒rAc-Cap-SS，其特征在于该重组杆状病毒带有猪圆环病毒2型Cap蛋白基因开放阅读框和生长抑素基因形成的融合基因0RF2-SS。
2.根据权利要求1所述的融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒rAc-Cap-SS，其特征在于所述的融合基因0RF2-SS序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.根据权利要求2所述的融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒rAc-Cap-SS，其特征在于该重组杆状病毒保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期:2010年12月17日，保藏号=CGMCC No. 4459。
4.权利要求1所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS在制备猪圆环病毒2型疫苗中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于重组杆状病毒rAc-Cap-SS为保藏号为 CGMCCNo. 4459 的毒株。
6.一种亚单位疫苗，其特征在于含有权利要求1所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素的融合蛋白BCap-SS和佐剂。
7.根据权利要求6所述的亚单位疫苗，其特征在于所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS为保藏号为CGMCC No. 4459的毒株。
8.根据权利要求7所述的亚单位疫苗，其特征在于所述的融合蛋白BCap-SS序列如 SEQID NO. 7 所示。
9.权利要求6所述的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于将重组杆状病毒rAc-Cap-SS 接种Sf9细胞，27°C培养，72小时后收获细胞，PBS洗涤，加入PBS，于冰上超声裂解细胞，裂解物经12000rpm，4°C，离心15min，取上清测定蛋白浓度后与佐剂混合制得亚单位疫苗。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒及重组亚单位疫苗。融合表达猪圆环病毒2型Cap蛋白和生长抑素SS的重组杆状病毒保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2010年12月17日，保藏号CGMCC No.4459的。一种亚单位疫苗，含有所述的重组杆状病毒rAc-Cap-SS表达的PCV2Cap-SS融合蛋白BCap-SS和佐剂。本发明首次提出了用杆状病毒表达系统融合表达PCV2 Cap蛋白与生长抑素SS该重组杆状病毒对外源蛋白表达稳定，表达的重组蛋白能诱导产生了针对PCV2的特异抗体，并可促进增重。
文档编号A61K39/00GK102363770SQ20111030906
公开日2012年2月29日 申请日期2011年10月13日 优先权日2011年10月13日
发明者姜平, 李文良, 李玉峰, 王先炜 申请人:南京农业大学