携带双链rna靶抗原和中和抗原的假病毒颗粒疫苗的制作方法

专利名称：:携带双链rna靶抗原和中和抗原的假病毒颗粒疫苗的制作方法携带双链RNA靶抗原和中和抗原的假病毒颗粒疫苗
技术领域：
：本发明涉及一种携带双链RNA靶抗原和中和抗原的假病毒颗粒疫苗，该疫苗可进行基因转移、免疫和疫苗接种，属于生物
技术领域：
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背景技术：
慢病毒是一种RNA病毒，属于逆转录病毒科，因其病毒颗粒中含有依赖RNA的逆转录酶而得名。慢病毒基因主要编码gag,pol和env3个基本的结构蛋白，以及4个辅助蛋白和2个调节蛋白。该科病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV),猴免疫缺陷病毒(SIV)，白血病病毒等，其中以HIV-I的研究最多，并在相关研究的基础上发展出慢病毒载体系统，被广泛应用于基因转导与基因表达等方面的研究[1-3]。慢病毒载体的构建的基本原理就是将HIV-I基因组中的顺式作用元件和编码反式作用因子的序列进行分离。整个载体系统由包装部分和载体部分构成包装部分去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，但能够反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体部分则含有包装、逆转录和整合所需的HIV-I顺式作用序列，并具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。载体包含的结构基因包括编码病毒的核心蛋白的gag基因，基因编码病毒复制所需酶类的pol，编码病毒的包膜糖蛋白的env基因，以及编码切割蛋白前体所需的蛋白酶的pro基因[4]。1996年，为了进一步降低两部分基因发生同源重组而生成具有复制能力的病毒的可能性，Naldini等人采用表达水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G的质粒和双嗜性小鼠白血病病毒(MLV)包膜蛋白Env的质粒，取代表达HIV本身包膜蛋白Env的质粒，包装获得了以HIV-Igagpol为骨架，以VSV-G或MLV-E蛋白作为包膜的嵌合病毒。该方案突破了最初的HIV-I载体仅对CD4+细胞的亲嗜性限制，并且病毒滴度可达到IO7108TU/ml。这为采用逆转录病毒载体进行其他病毒的包膜蛋白功能研究提供了方便[5-6]。通过对载体序列的优化和改造，慢病毒载体作为基因治疗工具已有大量文献报导[7-9]。与其他病毒载体相比，其优点主要表现为1.能高效转导广泛的细胞(包括DC细胞)。2.针对载体骨架的免疫原性较弱，可多次反复加强免疫。3.体外转导特异抗原的DC可引起较强的体内外细胞应答。但是，单纯采用慢病毒载体作为疫苗，其需要能够稳定、永久地整合到宿主染色体上,通过持续表达目的蛋白刺激机体才能产生相应的免疫反应,从生物安全性方面而言，这是一个极大的缺陷。所以，本发明着眼于采用慢病毒载体转染细胞包装获得的假型病毒颗粒作为疫苗应用[10-12]。Toll样受体(Toll-likereceptors,TLR)是参与非特异性免疫的一类极其重要的蛋白受体，是连接天然免疫和特异性免疫的桥梁。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、粘膜等时，TLR可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。新近研究发现，病毒复制的中间产物双链RNA能被TLR3特异识别，通过激活NF-κB和干扰素IFN-β前体诱导炎症细胞释放I型干扰素，从而增强抗原特异性CD8+T细胞应答，促进树突状细胞的抗原呈递，激活抗病毒天然免疫[13-16]。因此本发明将能编码病原蛋白的双链RNA引入假病毒颗粒，一方面可利用其与TLR3的结合激活天然免疫，另一方面可通过介导其在宿主细胞的表达从而诱导产生病原特异的细胞免疫反应。本发明具有以下特点1.利用反式互补技术，可利用慢病毒载体快速获得携带天然构象中和抗原的假型病毒颗粒，并可对包膜蛋白进行人工突变快速获得相应的病毒样颗粒。2.与其他蛋白亚单位疫苗相比，假病毒颗粒更稳定，并可通过超离方法或超滤浓缩纯化。3.对于难以培养或表达的病毒糖蛋白以及存在生物安全隐患的病毒，假病毒颗粒的制备是一种可选择的替代途径。4.结合双链RNA佐剂效应的假病毒颗粒疫苗可兼顾病毒颗粒样(VLP)疫苗与DNA疫苗两者的优势，同时激发天然免疫，和抗原特异的体液免疫与细胞免疫，可以用于多次同型或异型疫苗联合免疫。基于以上特点，通过基因改造获得携带双链RNA靶抗原和中和抗原的假病毒颗粒疫苗进行基因转移、免疫和疫苗接种相关应用具有良好的前景。
发明内容本发明的目的是提供一种免疫效果好、安全、制备周期短的采用假型慢病毒颗粒的新型疫苗及其制备方法。该型疫苗可以刺激机体产生体液与细胞双重免疫应答，可用于防治HCV，流行性感冒等病毒感染性疾病。在本发明的第一方面，提供了包装获得假型慢病毒颗粒所需的三质粒包装系统。具体包括I.包装质粒PCMVDR8.2D64E:整合酶区域第64位氨基酸D(GAT)突变为E(GAG)，使其成为整合酶缺陷的包装载体。2.转导质粒PCS:具有自我灭活特性的并且带有佐剂基因，除此之外还可选择插入其他抗原蛋白基因或报告基因。其携带的表达基因将随假病毒颗粒转染宿主细胞并进行表达。3.表达质粒包含完整的病原包膜蛋白基因系列，可高效表达目的病原的包膜蛋白。所述的表达质粒，可在包括pVRC、phCMV、pcDNA3.I、pcDNA6.0、pCIneo(+)、pReceiver等真核表达质粒中进行优选。在本发明的第二方面，提供了一种假型慢病毒颗粒，它由权利要求I所述的重组表达质粒转染靶细胞后表达形成，除含有按要求插入病原蛋白编码序列外不含慢病毒核苷酸。所述的靶细胞包括BHK21、293、239T、Hela等来源于真核生物的传代细胞系。在本发明的第三方面，提供了一种药物组合，它含有上述重组表达质粒表达的假型慢病毒颗粒和药学上可接受的佐剂或载体。在本发明的第四方面，提供了本发明的假型慢病毒颗粒的用途，用于制备预防和治疗丙型肝炎或流感的药物。在本发明的第五方面，提供了一种制备假型慢病毒颗粒的方法，包括以下步骤I)将权利要求I所述的含有病原微生物结构蛋白编码序列的重组表达质粒对靶细胞进行瞬时转染。2)当所述的祀细胞充分表达抗原结构蛋白时,收获细胞上清。3)将上清过滤去除细胞碎片后，采用蔗糖超速离心对病毒进行分离富集，亦可采用免疫亲和层析进行分离纯化。药物组合本发明所述的药用组合物可以包含实际使用时所选用的药学上可以接受的缓冲齐U，也包含用于预定用途的其它物质。本领域已有多种缓冲剂适用于预定用途，本领域的技术人员都善于选择的缓冲剂。在一些实例中，该药用组合可以含有药学上可接受的保湿齐U，药学上可接受的各种保湿剂在多种公开出版物都有叙述，包括如中华人民共和国药典(2010版)。所述的药用组合物可制备出各种剂型，如注射剂、片剂、丸剂、胶囊、喷雾剂等。适用于局部使用和口服的药用级别的有机或无机载体或稀释剂。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油脂。还可用稳定剂、乳化剂、维持PH值的各种缓冲剂和皮肤渗透增强剂等作为辅助材料。当本发明用作疫苗时，假型慢病毒颗粒疫苗可采用多种方法进行配制。通常情况下，按本领域熟知的各种方法，用药学上可以接受的载体或运载体配制本发明的疫苗。合适的药用载体包括无菌生理盐水，也可用其它无菌的水性和非水性的等渗注射液，是本领域技术人员熟知的药学上可接受的载体。配制本发明的疫苗组合物时还可含有其它成分，如佐剂、稳定剂、PH调节剂、防腐剂等。这些成分都是疫苗领域的技术人员所熟知的。佐剂包括(但不限于)铝盐佐剂、皂苷佐剂、CpG佐剂等。稳定剂包括(但不限于)精氨酸、乙基纤维素、多元醇、氨基酸、无机盐、PEG等。给药途径与剂量当用作疫苗时，可用本领域技术人员熟知的方法将本发明的假型慢病毒颗粒疫苗施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径或模拟病毒感染的途径施用这些疫苗。采用疫苗组合物的形式时，除含有假型慢病毒颗粒外，还可包括药学上可以接受的载体、佐齐U、稳定剂、pH调节剂等。给药常规与途径包括肌肉注射、皮下注射、滴鼻、静脉注射、经口服等，如果需要也可采用组合给药途径。疫苗组合物的给用剂量可以单剂量，也可多剂量，且可给予加强剂量以维持被施用个体的免疫力。在所选用的给药途径中，应以"有效剂量"为给予假型慢病毒颗粒疫苗的量，足以引发被施用个体的免疫应答，能有效保护被施用个体抵抗目的病原微生物的感染。所述的有效剂量，是指在疫苗组合物中所选用的假型慢病毒颗粒疫苗的量是按可引发个体免疫保护性应答而无明显的副作用的量确定。本发明以疫苗组分中P24蛋白抗原的定量为基础计算有效剂量，该剂量包括例如相当于O.5ng至5000ngp24抗原的载体颗粒。在小鼠中，优选剂量可为O.5ng至50ng，而在马中优选剂量可为50ng至500ng。具体疫苗的最佳用量可通过实验免疫后观察对象的抗体滴度和其它反应来确定，通过检测疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量，施用佐剂或免疫刺激剂可提高本发明假病毒颗粒的免疫应答，这些都是本领域的技术人员所熟知的。本发明人经过深入的研究，建立了假型慢病毒颗粒疫苗制备技术，并快速制备获得了安全性好、免疫效价高的假型慢病毒颗粒疫苗，在此基础上完成了本发明。和现有技术相比，本发明具有以下优点I.提高了免疫的有效性假型慢病毒颗粒表面预免疫病原微生物的主要包膜蛋白成分，免疫宿主个体后可以产生对目的病原的免疫活性。并且由于假病毒的组织亲嗜性和感染过程与真病毒相同，因此可以模拟天然病毒的早期感染过程，有效刺激机体的免疫应答。2.提高了疫苗的安全性。[0032]本发明的假型慢病毒颗粒所含的核酸仅为单一抗原基因，为一过性表达，不具有复制和再度感染的能力，并且在载体构建过程中对载体的整合酶进行了功能缺失，极大的降低了载体随机整合的可能性，从而可以最大程度地降低疫苗使用的风险。3.操作简便，生产周期短。在构建了重组表达质粒后，转染细胞后收获上清，再经离心分离或过柱纯化即可获得该颗粒疫苗。步骤过程简单，从获得病原包膜蛋白基因到获得假型病毒颗粒，规范操作的周期仅为一周左右，并且扩增规模可以通过转染质粒量进行量化控制，非常适合应急病原疫苗的制备。图I:HCV假病毒颗粒包装系统的制备与鉴定a为包装质粒pCMVDR8.2D64E的结构图示及，突变后测序结果山为转导质粒pCS(pCS-NS3为例)结构示意，及瞬时转染293T细胞后的表达鉴定结果；c为表达质粒PVRC-E1E2的结构示意，及瞬时转染293T细胞后的表达鉴定结果。图2:HCV假病毒颗粒及其鉴定a为包装获得的假病毒颗粒结构示意图b为负染电镜显示的病毒颗粒形态；c和d为浓缩的病毒颗粒进行westernblot鉴定E2，P24,NS3的结果。图3=HCV假病毒疫苗免疫后的体液免疫反应测定a为单独采用HCV假病毒颗粒免疫，第二针与第四针免疫后采血检测的小鼠针对HCVE1，E2，NS3的特异性抗体水平；b为添加佐剂后第二，三，四针后检测的抗体水平。两者显示随着免疫次数的增加，抗体水平逐渐提高，而且不添加佐剂的抗体水平与添加组相似，说明本疫苗单纯免疫及有很好的免疫增强效果。图4=HCV假病毒疫苗免疫后的细胞免疫反应测定采用ELISP0T检测HCV假病毒颗粒疫苗免疫四针后小鼠针对HCVEl,E2，NS3的特异性T细胞免疫水平。具体实施方式下面以HCV假型慢病毒颗粒疫苗作为具体实施实例，对本发明进行阐明。应当指出，这些实例仅用于进一步阐明本发明，而不用于限制本发明的适用范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社，2005)等本领域常用工具书中所述的条件，或按试剂生产厂家所建议的条件进行。实施例I:假病毒包装系统的制备I.I整合酶缺陷的包装质粒pCMVDR8.2D64E的制备根据文献的报道，将包装质粒pHR’CMVAR8.2中聚合酶区域第64位氨基酸D(GAT)突变为E(GAG)，可以使整合酶活性丧失，却不影响转导效率[17，18]。具体流程如下I)将pHR’CMVΔR8.2质粒与含突变序列的pNL_IND64E质粒分别转化甲基化缺陷的E.coliK12细菌感受态2)质粒提取后均采用SalI和BclI双酶切，切胶回收pHR’CMVΛR8.2中的IOkb片段和PNL-IND64E中的3.4kb片段。[0046]3)将上述回收片段以I:5的摩尔比例连接后转化DH5a感受态。4)提取质粒酶切鉴定后测序确认。I.2转导质粒PCS-CG-NS3的制备及表达能力鉴定根据模板质粒PUC-H155序列设计引物，上下游引物各引入酶切位点。引物为NS3-5:TCTGCTAGCTGGTGGTGCTGGATATCAT(NheI)；NS3-3TCACTCGAGCATTAGGTCACCACTTCCA(XhoI)。将引物用无菌水稀释成10μΜ,反应体系为pfxDNApolymeraselμI,dNTP(2.5mΜ)6μI,IOXAmp.buffer5μI,模板5叩，1^041111，引物各2111，模板5^，无菌水补足至5(^1。？0反应条件为:94°C预变性5min；94°C30s，55°C退火30s，72°C延伸2min，共30个循环；最后72°C延伸IOmin15PCR产物经I%琼脂糖凝胶电泳检测大小，片段大小预期约为1900bp。切胶回收，取55μ1Elutionbuffer洗脱,琼脂糖凝胶电泳估计浓度约为IOOng/μI。用NheI和XhoI分别酶切PCR产物和载体pCS_CG，酶切体系如下PCR产物(NS3)I.5μg，酶NheI和XhoI各I.5μ1,10Xbuffer25y1，BSA0.5μI，无菌水补至50μI；载体pCS-CG取2μg，酶NheI和XhoI各2μ1，10Xbuffer25y1，BSAO.5μI，无菌水补至50μI;37°C酶切2h。I%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收。将回收的载体和片段于16°C连接过夜转化DH5a感受态，同时设载体对照和自连对照。连接产物转化后的单克隆菌落做菌落PCR初步鉴定正确后，提质粒酶切以及测序进一步鉴定其正确性。在经多克隆筛选及测序鉴定无误后，大量扩增获得超纯无内毒素质粒。取适量质粒对293T细胞进行瞬时转染后收集细胞进行WesternBlot检测，通过特异性单克隆抗体检测可见在相应位置有明显的阳性条带(图lb)。按脂质体试剂说明书(Lipofectamine2000,Invitrogen)转染293T细胞，具体方法如下I)转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293FT细胞，以含10%血清的培养基调整细胞密度为5X105细胞/ml，重新接种于25cm2细胞培养瓶，37°C、5%C02培养箱内培养。24h后待细胞融合度达70%-80%时即可用于转染。2)转染前2h将细胞培养基更换为无血清培养基。3)向一灭菌离心管中加入所制备的各质粒溶液(pCMVDR8.2D64E载体8μg，PCS-NS3质粒4μg.pCMV-CElE2质粒4μg)。与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为O.3时，在室温下孵育5分钟。4)将Lipofectamine2000试剂轻柔摇勻，取50μILipofectamine2000试剂在另一管中与O.3mlOpti-MEM混合，在室温下孵育5min。5)把稀释后的质粒与稀释后的Lipofectamine2000进行混合,轻轻地混勻后，室温孵育15min。6)将Lipofectamine2000与质粒混合液小心加入至293FT细胞的培养液中，混匀，于37°C、5%C02细胞培养箱中培养。7)培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入5ml的pH值为7.4的PBS液，轻轻洗去残余的转染混和物后倒去。8)每瓶细胞中加入5ml含10%血清的细胞培养基，于37°C、5%C02培养箱内继续培养48小时。收集细胞后，参照《分子克隆实验指南》的SDS-PAGE方法进行样品处理和电泳，电转移到硝酸纤维素膜上，用小鼠抗NS3的单克隆抗体作一抗，IRdye-800cw标记的兔抗小鼠抗体(Licor公司)作二抗进行免疫印迹(Westernblot)鉴定,有特异性抗原表达者为稳定转染细胞克隆。附图Ib显示了Westernblot鉴定结果,说明质粒能有效表达NS3蛋白。I.3表达质粒PVRC-E1E2的制各在真核表达质粒pVRC的多克隆位点，将编码HCV包膜蛋白E1E2的基因序列插入。在经多克隆筛选及测序鉴定无误后，大量扩增获得超纯无内毒素质粒。取适量质粒对293T细胞进行瞬时转染后收集细胞进行样品处理和电泳，电转移到硝酸纤维素膜上，用小鼠抗HCVEI,E2的单克隆抗体作一抗,IRdye-800cw标记的兔抗小鼠抗体(Licor公司)作二抗进行免疫印迹(Westernblot)鉴定，有特异性抗原表达者为稳定转染细胞克隆。附图Ic显示了Westernblot的鉴定结果,说明质粒能有效表达HCVE1,E2蛋白。实施例2=HCV假病毒颗粒的制备2.I细胞培养采用含10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco'smodifiedEaglemedium,DMEM)(GIBCO)培养人293FT细胞。培养条件为37°C>5%C02。细胞传代方法如下I)弃去旧培养液，加入5ml灭菌PBS溶液，轻轻清洗细胞后弃去。2)加入Iml胰酶消化液，轻轻流过细胞后弃去，用残存液体消化细胞l_2min，直到细胞完全消化下来。3)加入含10%胎牛血清的DMEM完全培养基5ml，用刻度吸管吹打，将瓶壁上的细胞冲洗下来。4)补加液体至10ml，混匀后分至两个新的培养瓶中，继续培养。细胞株的冻存I)取培养2-3天生长旺盛的细胞，用含90%胎牛血清和10%二甲基亚砜配成冻存液，将细胞配成2x106-2x107个/ml。2)在Iml细胞冻存管中加入Iml细胞悬液，混匀后密封。置4°CIh,-20°C2h，然后直接放入液氣中或直液氣蒸汽上过夜后浸入液氣中。细胞复苏I)从液氮罐中取出细胞冻存管。2)迅速放入盛有37°C温水的水浴中解冻。3)用70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3ml含10%FBS的DMEM完全培养基，置37°C、5%C02孵箱培养。4)次日更换一次培养液后再继续培养。2.2质粒转染293FT细胞采用脂质体(Lipofectamine2000,Invitrogen)介导质粒转染,具体方法与前述质粒鉴定方法相同。2.3假病毒颗粒的分离根据慢病毒载体的特性，使用20%蔗糖超速离心的方法进行浓缩和纯化。具体方法如下I)收集转染后48/h的293FT细胞上清液。[0086]2)于4°C，4000g离心lOmin，除去细胞碎片后以O.45μm滤器过滤上清液。3)把病毒粗提液样品小心加入5ml20%蔗糖溶液上方，SW32超速离心管(Beckman超速离心机)，4°C,22000rpm超速离心120min。4)弃去上清，浙干后加入适量PBS溶解后即为病毒浓缩液。5)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-80度长期保存。取其中一支进行病毒生物学滴度测定。图2显示其电镜与westernblot鉴定结果。实施例3=HCV假病毒颗粒疫苗的动物实验为证实假型慢病毒的免疫效果，我们采用分别采用HCV假病毒颗粒疫苗，DNA疫苗，腺病毒载体疫苗对BalB/c小鼠进行免疫后，比较分析其免疫效果。3.I疫苗的制备方法HCV假病毒颗粒疫苗由本单位自制，为表面为HCVE1E2包膜蛋白并携带HCVNS3基因的假型慢病毒。由于HCV病毒有不同的型别，E1E2在不同型别的差别较大，本实例选取了中国流行率较高lb，作为HCVE1E2模板制备了表达质粒，并包装获得了相应型别的假病毒颗粒。并根据p24定量，以注射用生理盐水配置成20ug/ml。添加佐剂的疫苗组,选用氢氧化招佐剂1.Omg/ml(按Al3+计算，lmg/ml)。免疫分组分组---------_^第一针(O周)第二针(3周)第三针(6周)第四针(9周)A__HCVpp__HCVpp__HCVpp__HCVppBHCVpp+佐齐IJ__HCVpp+佐齐IJ__HCVpp+佐剂HCVpp+佐剂C_PBS__PBS__PBS_PBS动物免疫雌性SPF级BALB/c小鼠，体重16-18克，每组12只。于第0、28天肌肉注射蛋白疫苗，免疫剂量O.Iml0第98天时采用Ad-SSl免疫，免疫剂量O.1ml，肌肉注射。每次免疫后两周眼眶采血，并于末次免疫后两周摘眼球取血，分离血清，测定前冻存于-20°C。将小鼠脱颈处死后无菌取脾，研磨分离获得脾细胞悬液，计数调整细胞浓度后立即用于ELISP0T检测。免疫保护效果检测I.小鼠血清中E1E2特异性IgG的ELISA测定采用真核表达的HCVEl,E2蛋白包被ELISA板。将小鼠血清以PBS从I:100作倍比稀释，以PBS组I:50稀释后检测的A450/650值的平均值的2.I倍作为(Cutoff)界值，各组实验动物血清抗E1，E2的几何平均滴度见图3a。2.小鼠血清中NS3特异性IgG的ELISA测定采用原核表达的C44p蛋白包被ELISA板。将小鼠血清以PBS从I:100作倍比稀释，以PBS组I:50稀释后检测的A450/650值的平均值的2.I倍作为(Cutoff)界值，各组实验动物血清抗-NS3的几何平均滴度见图3b。3.HCVEI,E2，NS3特异性细胞免疫测定小鼠Y-IFN细胞因子ELISP0T试剂购自BD公司。按说明书操作，在包被抗用抗γ-IFN抗体后，每孔加入100ul含El，E2，NS3抗原多肽的脾细胞培养悬液，每孔脾细胞数为5x105个，37°C5%C02静置培养24h;弃去培养液后，分步加入检测抗体和显色液显色，Bioreader4000斑点分析仪计数斑点形成数(SFC)。根据斑点数的多少判断特异性杀伤T细胞的数量，该数量的多少与细胞免疫强度呈正相关。结果见图4。参考文献[I]李振宇，徐开林.慢病毒载体构建及结构优化[J].国外医学分子生物学分册，2002，24:310-313.[2]Suzuky,Y.,Craigie,R..Theroadtochromatin-nuclearentryofretroviruses[J].Naturereviews.Microbiology:2007,5(3)187-96.[3]SolaimanF,ZinkMA,XuG,etal.Modularretro-veetorfbrtransgenicandtherapeuticuse.MolecularReprodDevelop,2000,56:309-315.[4]邓继先，沈伟.用慢病毒载体制备转基因动物的研究进展[J].生物工程学杂志·2004，24(9):18-20.[5]NaldiniL,BlQmerU，GallayP，OryD，etal.Invivogenedeliveryandstabletransductionofnondividingcellsbyalentiviralvector[J].Science.1996；272(5259):263-7.[6]DulITiZuffereyRiKellyM，etal.Athird-generationlentivirusvectorwithaconditionalpackagingsystem[J].JVirol.1998,72(11):8463-71.[7]HuB，TaiA,WangP.Immunizationdeliveredbylentiviralvectorsforcancerandinfectiousdiseases[J].ImmunolRev.2011Jan；239(1):45-61.[8]YoshimitsuM，SatoT，TaoK.BioluminescentimagingofamarkingtransgeneandcorrectionofFabrymicebyneonatalinjectionofrecombinantlentiviralvectors[J].PNAS.2004(48):16909-14.[9]ZuffereyR，ThomasDull，RonaldJ.MandeI,etal.Self-inactivatinglentivirusvectorforsafeandefficientinvivogenedelivery[J].JViroll998；72:9873-9880.[10]Fischer,A.andM.CavazzanaCalvo.IntegrationofRetrovirusesAFineBalancebetweenEfficiencyandDanger[J].PLoSMed.2005,2(I):22-24.[ll]DirkNehring，RalfPoertner，MatthiasSchweizer,etal.IntegratedinlinefiltrationAmethodtoproducehighlyconcentratedretroviralvectortitersupernatant[J]·Desalination，2009，246(246):241-247.[12]TeresaRodriguesa，ManuelJ.T.Carrondo，PaulaM.Alvesa,etal.PurificationofretroviralvectorsforclinicalapplicationBiologicalimplicationsandtechnologicalchallenges[J].JournalofBiotechnology，2007，127(3):520-541.[13]ChristianeSH，MartinE,EdithJ，etal.SyntheticDouble-StrandedRNAsAreAdjuvantsfortheInductionofTHelperIandHumoralImmuneResponsestoHumanPapillomavirusinRhesusMacaques[J].PLoSPathog.2009,5(4):1-15.[0117][14]SalaunB，GreutertM,RomeroP.Toll-likereceptor3isnecessaryfordsRNAadjuvanteffects.Vaccine[J].2009Marl3；27(12):1841-7.[15]BotosI,LiuL,WangY,SegalDM,etal.Thetoll-likereceptor3:dsRNAsignalingcomplex[J].BiochimBiophysActa.2009Sep-Oct;1789(9-10):667-74.[16]孙瑞利，张宇，胡锦跃.Toll样受体3在病毒感染及细胞凋亡中的生物学功能[J]·国际病理科学与临床杂志.2009，29(I):37-40.[17]LeavittAD,ShiueLandHEVarmus.Site-directedmutagenesisofHIV-Iintegrasedemonstratesdifferentialeffectsonintegrasefunctionsinvitro[J].J.Bio.Chem，1993；268:2113-2119.[18]EngelmanA.InVivoAnalysisofRetroviralIntegraseStructureandFunction[J].Adv.VirusRes.199952:411_426。权利要求1.一种携带双链RNA靶抗原和中和抗原的假病毒颗粒疫苗，该疫苗具有在施用于动物时能同时产生体液和细胞免疫反应的药物用途，该假病毒外膜包含病原微生物的中和抗原，同时携带具有分子佐剂效应并能编码抗原的双链RNA。2.如权利要求I所述的假病毒颗粒疫苗，其核心特点在于采用具有分子佐剂效应并能编码抗原的双链RNA取代荧光报告基因，利用假病毒的基因携带能力将其导入宿主细胞并在宿主细胞表达，从而诱导产生抗原特异性的细胞免疫反应。3.如权利要求I所述的假病毒颗粒疫苗，其特征在于，所述包装质粒选自己经改造为具整合缺陷特性的pCMVAR8.2D64E;真核表达载体和自灭活的慢病毒转导质粒pCS。4.如权利3所述的pCMVAR8.2D64E质粒，为包装质粒，为在pCMVAR8.2质粒基础上将HIV整合酶的64位氨基酸D突变为E，使该质粒不具有整合酶活性。5.如权利2所述的表达载体，为包含病原微生物中和抗原基因的真核表达质粒。6.如权利2所述的pCS载体，为包含具有分子佐剂效应并能编码抗原的双链RNA的自灭活载体质粒。7.如权利要求1-3中任一项所述的假病毒颗粒疫苗，其特征在于，该系统包括使用含有病原微生物的中和抗原基因的真核表达质粒和能编码抗原的双链RNA的转导质粒以及包装质粒共转染宿主细胞，培育该宿主细胞，和从培养基上清中收集假病毒颗粒。8.如权利要求1-7所述病原微生物，包括丙型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，流感病毒，呼吸道合胞病毒，黄热病毒，登革热病毒，人类免疫缺陷病毒等。9.假病毒颗粒以及可接受的生理载体和/或佐剂用于制备针对微生物感染的疫苗的用途，所述假病毒颗粒包含病原微生物的表面中和抗原，并含有以下异源核酸能编码抗原的双链RNA，所述疫苗可一次或多次对有此需要的动物施用。10.权利要求9的用途，其中所述病原微生物在此以丙型肝炎病毒为具体实例，其中所述表面中和抗原为El和E2蛋白，异源核酸编码丙型肝炎病毒NS3蛋白、其变体或其片段，并带有可接受的生理载体和/或佐剂。11.权利要求9或10的用途，其中所述假病毒颗粒通过腹膜内途径、静脉内途径、肌内途径、经口途径、粘膜途径、舌下途径、皮下途径、鼻内途径或皮内途径施用。12.权利要求11的用途，其中所述假病毒颗粒通过肌内途径施用，并且其中所述有此需要的动物为人，大猩猩，啮齿类动物。13.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1-9所述的假病毒颗粒和药学上可接受的载体。14.如权利要求I所述的假病毒颗粒的用途，其特征在于，用于制备治疗和预防以下疾病的药物肿瘤、病毒性疾病。专利摘要发明名称携带双链RNA靶抗原和中和抗原的假病毒颗粒疫苗。所属
技术领域：
：1.生物技术2.基因工程疫苗。本发明涉及一种携带双链RNA靶抗原和中和抗原的假病毒颗粒疫苗，该疫苗通过采用整合缺陷的pCMVΔR8.2D64E包装质粒、pCS转导载体和中和抗原表达载体共同转染宿主细胞后，即包装获得颗粒表面呈现中和抗原而核心携带具有佐剂效应的双链RNA靶抗原基因的假病毒颗粒疫苗。本疫苗为颗粒疫苗，易于收获，抗原性强，并且应用安全，在多种病原，尤其是突发病毒感染性疾病的防治中具有良好的应用前景。文档编号A61P35/00GKCN102961757SQ201210431175公开日2013年3月13日申请日期2012年11月2日发明者谭文杰,邓瑶,管洁,文波申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan