用于检测猪流行性腹泻病毒中和抗体的抗原及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测猪流行性腹泻病毒中和抗体的抗原及其制备方法和应用。所述抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明将PEDV主要表面抗原S蛋白在体外表达系统中分段表达，获得7个纯化的多肽抗原，从中筛选出1个多肽抗原，可用于检测PEDV中和抗体。所述的抗原在制备检测猪流行性腹泻病毒中和抗体试剂中的应用。所述抗原采用成熟表达系统生产，产量大易于后续中试及扩大生产，易于商品化。
CCTCC V201428
2014.09.04
【专利说明】用于检测猪流行性腹泻病毒中和抗体的抗原及其制备方法 和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及用于检测猪流行性腹泻病毒中和抗体的抗原 及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea ;PED)最早暴发于1971年英国架子 猪及育肥猪群，其病原为猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus ;PEDV)。 PEDV 与猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus ;TGEV)、猫冠状病 毒、犬胃肠炎病毒和人冠状病毒229E同属冠状病毒科冠状病毒属I群。根据报道该病毒自 然宿主仅为猪，也有报道显示PEDV可适应小鼠传代并具小鼠神经毒力。PEDV主要导致中大 猪腹泻，1976年发现该病也可导致乳猪群发生急性腹泻。目前，PEDV导致仔猪发病的致病 机理也已阐明，即仔猪接触病毒后在小肠内复制导致细胞变性，肠绒毛脱落，致使体内水分 外排，猪只电解质紊乱，而PEDV针对较大猪的致病机理尚不十分清楚。
[0003] 欧洲对此病的报告主要集中于断奶猪或架子猪顽固性、重复发生的水样腹泻，其 可造成生长迟滞，但死亡不常见。而在亚洲PEDV引起的腹泻致死率更为严重，且从临床上 与典型的TGEV极为相似，暴发的特点是所有年龄的猪均发生水泻。新生仔猪因水泻和脱水 而死亡，死亡率为50-100%。在韩国，该病呈全国性流行，几乎全年都可发生，但常发于寒冷 季节。1992年1月至1993年12月之间，韩国兽医研究所诊断的71个病毒性肠炎病例中， 56. 3%确诊为PED，90%发病的仔猪日龄在10日龄以内；从1997年8月到1999年7月，韩 国5个省份1258个肠道病例中，50. 4%被诊断为猪流行性腹泻。日本在1993-1994年间以 及在1996年报告了若干次发病，分别有14000和39000头新生仔猪死亡。在1996年冬天， 日本9个县108个哺乳仔猪和育肥猪场发生PED，其中56256头仔猪中死亡39509头。
[0004] 我国于1980年首次分离到PEDV后，陆续有多地报道PED的流行。据王明等报道， 近年来PED在我国流行面逐渐扩大，其对26个省、市、自治区的调查表明，PED的总死亡率 占36种猪病总死亡率的1. 74%。PEDV的发病呈现仔猪高死亡率、反复发病等新的特点，对 国内养猪业造成重大经济损失。PEDV流行难以防控的主要原因在于其独特的局限性肠道上 皮致病特点。
[0005] 胎儿上皮绒毛膜胎盘在母猪妊娠期形成，乳猪出生后其消化道在短短的几周内会 经历一系列变化，采食初乳的24小时内，猪胃、胰腺、小肠会快速生长，乳猪要快速适应从 胎盘营养到肠内营养的转变。而这一过程是复杂、快速突然的，在这一时期胎儿肠道具有特 殊的生理特点，出生后48小时内的仔猪，其肠道能够直接摄取大量的大分子物质，肠道这 种胞饮作用没有选择性，在出生后的48小时内逐渐停止（称作肠道关闭）。这一过程中一 方面有利于大分子的免疫球蛋白的直接吸收，尽快通过被动免疫保护仔猪免受疫病侵扰； 但同时也为抗原或致病性大分子的非特异吸收提供便利。此外，尽管仔猪出生时就存在免 疫系统的分子成分，但在数量上和功能上都不成熟，同时胃肠道PH值等非特异屏障并没有 完全建立使得病原分子更易乘虚而入。
[0006] 2010年到2012年PEDV暴发导致国内大量乳猪死亡，其死亡率与乳猪日龄呈反比， 即1到4日龄乳猪感染后纠正病损的几率很小，仔猪越大死亡率会降低。根据上述初生乳 猪生理特点可知，如果母猪带毒且病毒滴度较高，同时初乳中和抗体效价低，则PEDV在仔 猪初生后48小时内可能经肠道非特异吸收、大量富集，导致肠道上皮细胞迅速脱落，最终 导致仔猪脱水死亡。
[0007] 依据初生仔猪出生后特殊肠道生理特点，仔猪初生健康水平取决于母猪健康程 度，根据已有文献可知母猪群体抗体水平的高低体现了猪群抵抗PEDV流行及发病能力的 强弱，因此定期监测母猪抗体水平，特别是中和抗体水平是预防监测猪场PEDV流行趋势的 重要手段。
[0008] 中和试验是检测PEDV中和抗体的金标准，但其操作繁琐，需要特殊的场地和仪 器，不易应用于现地。有人将PEDV全病毒抗原作为包被抗原组装ELISA检测系统应用于现 地检测，其结果与中和试验具有较高相关性。但以PEDV全病毒作为包被抗原，存在生物安 全隐患。因此，研发安全、有效的用于检测PEDV中和抗体的抗原，是本领域的研究重点。
【发明内容】
[0009] 有鉴于此，有必要针对上述的问题，本发明提供了用于检测猪流行性腹泻病毒中 和抗体的抗原及其制备方法和应用。
[0010] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0011] 用于检测猪流行性腹泻病毒中和抗体的抗原，其核苷酸序列如SEQ ID NO :4所示。
[0012] 上述抗原的制备方法，包括如下步骤：
[0013] ①将PEDV毒株主要抗原基因依据冠状病毒抗原区域及接头覆盖原则分段，其3' 端为载体His标签，重组基因片段均通过特异性引物从PEDV毒株基因组中扩增而来；
[0014] ②将扩增得到的基因及所带标签基因克隆至载体质粒内，获得相应的重组质粒； 大量繁殖重组质粒后，将其转化至原核表达系统的宿主菌株或真核表达系统的宿主细胞中 表达目的蛋白；
[0015] ③利用Ni离子层析柱纯化目的蛋白，通过SDS-PAGE及Western-blot确定目的蛋 白的表达及纯化，获得纯化的多肽抗原。
[0016] 优选地，当步骤②中使用的表达系统为原核表达系统时，具体步骤为：将扩增得到 的基因片段插入原核表达载体pET32a相应酶切位点处，经PCR筛选及测序，筛选出阳性重 组子；用重组质粒转化BL21大肠杆菌感受态细胞，通过LA琼脂板及PCR鉴定含重组质粒的 工程菌；将重组菌接种至LA培养基之后待菌液OD至0. 6?0. 8时，以异丙基硫代半乳糖苷 作为诱导剂诱导重组蛋白表达。
[0017] 上述抗原在制备检测猪流行性腹泻病毒中和抗体试剂中的应用。
[0018] 本发明采用主要抗原蛋白部分重叠分段表达技术，应用不同表达系统生产安全、 纯净的PEDV中和抗体检测抗原。本发明将PEDV主要表面抗原S蛋白在体外表达系统中分 段表达，获得7个纯化的多肽抗原，从中筛选出1个多肽抗原，可用于检测PEDV中和抗体。 应用该多肽抗原作为间接ELISA包被抗原，可大规模检测猪群PEDV中和抗体。
[0019] 本发明用于检测PEDV中和抗体的抗原及其制备方法和应用具有明显的优点和有 益效果：
[0020] (I) PEDV刺激机体产生抗体的主要结构蛋白为S蛋白，过去认为不同毒株S蛋白 存在差异大、变异快的特点，因此常以全病毒及保守蛋白作为抗体检测包被抗原，全病毒存 在制备及特异性问题，而保守蛋白由于并非病毒的主要抗原蛋白，因此不适用于检测群体 抗病毒性抗体。SP4位于PEDV主要抗原基因S上，同时具备了稳定及特异两方面特点，可以 用来评估群体免疫状态。
[0021] (2)利用现地背景未知血清进行中和试验可以较好的模拟不同片段应用于现地 的情况，结果显示以SP4作为间接ELISA方法包被抗原可以很好地鉴别高抗体水平样品及 低抗体水平样品。
[0022] (3)抗原蛋白采用成熟表达系统生产，产量大，易于后续中试及扩大生产，易于商 品化。
【专利附图】
【附图说明】
[0023] 图1为PEDV S蛋白分段表达示意图。
[0024] 图2为SP1-SP7核酸电泳图。
[0025] 图3为IPTG诱导SP1-SP7表达的SDS-PAGE电泳图。
[0026] 图4为纯化的SP1-SP7的SDS-PAGE电泳图。其中，M :Marker ;泳道1-7分别代表 SP1-SP7 的 SDS-PAGE 电泳条带。
[0027] 图5为纯化的SP1-SP7的Western-blot鉴定图。其中，M :Marker ;泳道1-7分别 代表SP1-SP7的SDS-PAGE电泳条带。
[0028] 图6不同抗原ELISA检测结果与中和实验相关性分析。
[0029] 图7为不同抗原ELISA检测结果ROC曲线分析。
[0030] 图8为SP4真核表达抗原Western-blot鉴定结果。
[0031] 图9为SP4真核表达抗原ELISA检测结果ROC曲线分析。
[0032] 图10为不同毒株SP4蛋白变异情况示意图，其中星号所示为常用疫苗毒株。
【具体实施方式】
[0033] 为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例作进一步说明。如无特殊说明，本发 明中的方法、试剂都是本领域的常规方法、试剂。
[0034] 本发明根据已鉴定的PEDV抗原表位，并参考其它冠状病毒抗原表位的分布，将 PEDV的Sl基因及部分S2基因分成7段，在体外表达系统中对7段基因片段进行表达，获 得7个多肽抗原。分别以7个多肽抗原为包被抗原建立检测PEDV的间接ELISA方法。同 时用这7个不同抗原的ELISA方法和病毒中和试验对156个猪血清样品进行检测。比较 ELISA检测结果和病毒中和试验结果，根据ELISA结果与中和试验结果的相关性，筛选出适 合的多肽抗原。
[0035] 首先，根据PEDV及冠状病毒抗原表位分布，确定主要抗原表位分段策略，考虑到 多肽抗原接头部分存在未知抗原位点的可能性，不同抗原片段之间有部分重合。分段策略 见图1，图1中列出了不同多肽抗原在S蛋白上的相对位置。
[0036] 然后，按照不同表达系统表达蛋白的方法，将各分段基因及所带标签基因，克隆至 表达系统的载体质粒内，获得相应的重组质粒。大量繁殖重组质粒后，将其转化至原核表达 系统的宿主菌株或真核表达系统的宿主细胞中。通过宿主细胞表达目的蛋白，利用所带标 签及其相关纯化技术纯化目的蛋白，应用PEDV高免阳性血清及阴性对照血清完成不同片 段间接ELISA的系统构建。以中和试验结果为金标准依据相关系数（r)判断不同系统结果 与其接近程度完成片段的筛选。
[0037] 实施例1
[0038] 1、PEDV Sl及部分S2基因分段重组基因的扩增
[0039] (I)PEDV部分S基因分段策略及其合成
[0040] 根据软件预测S蛋白信号肽，分段表达时需去掉信号肽。依据PEDV已鉴定抗原区 域差别性分段原则，将PEDVSl及部分S2基因分为7段，分别命名为SP1-SP7,所述SP1-SP7 的核苷酸序列分别如SEQ ID NO : 1-7所示，所述SP1-SP7的氨基酸序列分别如SEQ ID NO : 8-14所示（见表1)。同时SP5-SP7还兼具补全接口的作用。上述7个片段均在3'端加入 His标签基因。
[0041] 表I SP1-SP7核苷酸序列及氨基酸序列
[0042]
【权利要求】
1. 一种用于检测猪流行性腹泻病毒中和抗体的抗原，其特征在于：其核苷酸序列如 SEQ ID NO :4 所示。
2. 权利要求1所述的抗原的制备方法，其特征在于：包括如下步骤： ① 将PEDV毒株主要抗原基因依据冠状病毒抗原区域及接头覆盖原则分段，其3'端为 载体His标签，重组基因片段均通过特异引物从PEDV毒株基因组中扩增而来； ② 将扩增得到的基因及所带标签基因克隆至载体质粒内，获得相应的重组质粒；大量 繁殖重组质粒后，将其转化至原核表达系统的宿主菌株或真核表达系统的宿主细胞中表达 目的蛋白； ③ 利用Ni离子层析柱纯化目的蛋白，通过SDS-PAGE及Western-blot确定目的蛋白的 表达及纯化，获得纯化的多肽抗原。
3. 根据权利要求2所述的抗原的制备方法，其特征在于：当步骤②中使用的表达系统 为原核表达系统时，具体步骤为：将扩增得到的基因片段插入原核表达载体pET32a相应酶 切位点处，经PCR筛选及测序，筛选出阳性重组子；用重组质粒转化BL21大肠杆菌感受态细 胞，通过LA琼脂板及PCR鉴定含重组质粒的工程菌；将重组菌接种至LA培养基之后待菌液 0D至0. 6?0. 8时，以异丙基硫代半乳糖苷作为诱导剂诱导重组蛋白表达。
4. 权利要求1所述的抗原在制备检测猪流行性腹泻病毒中和抗体试剂中的应用。
【文档编号】C07K14/165GK104292311SQ201410453990
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年9月5日 优先权日:2014年9月5日
【发明者】曹永长, 郝健伟, 薛春宜 申请人:中山大学