专利名称：一种抗IgA抗体检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及医疗器械领域，尤其涉及抗IgA抗体检测技术，特别是一种针对IgA缺乏者、自身免疫性疾病患者筛查抗IgA试剂盒。
背景技术：
现有技术中，有采用放射免疫技术、凝胶卡技术来进行抗IgA抗体检测的方法，这些方法对实验室要求高，有放射污染，操作复杂，需特殊配套仪器，成本昂贵，不适合针对献血者、患者进行筛查检测，不利于推广应用。现有技术中存在抗IgA抗体检测时间长、实验室要求高、对检测人员有危险的技术问题。IgA是一种免疫球蛋白，在血清总免疫球蛋白中含量为1(Γ15%。根据其α链的不同，可以分为IgAl和IgA2两个亚类。IgA2亚类有两种同种异型A2m (I)和A2m (2)，A2m (I)多见于白种人，A2m (2)多见于黑人和东方人种。目前由泛美免疫缺陷欧洲免疫缺陷协会(Pan-American Group for Immunodeficiencyand the European Society forImmunodeficiencies)定义4岁以上人群血清中免疫球蛋白IgG和IgM含量正常，免疫球蛋白IgA含量低于0.07g/L，为IgA缺乏症(IgAD)。IgA缺乏是人类最常见的免疫缺陷。献血者人群发生率因种族人群而异。在美国健康献血者中比例约1/328，西班牙1/163，白种人一般为1/600，日本人约为1/18500，中国人约为1/2000左右。 自身免疫性疾病的患者IgA缺乏频率更高。作为受血者，IgA缺乏症者IgA含量低于0.07g/L,当他们接触了含有IgA的血液制品就有可能产生特异性抗IgA抗体，今后有过敏输血反应的风险。作为献血者，他们可以成为稀有血型IgA缺乏者库的献血者，为同样是IgA缺乏的患者提供不含有IgA的血液成分。IgA缺乏症常被认为是患者反复呼吸系统和消化系统感染的潜在风险，这种感染会更加剧患者恶化成吸收不良、过敏和自身免疫性疾病的倾向。IgA可引起输血免疫反应，25-30%的IgA缺乏症患者受到免疫刺激后，可产生抗IgA抗体，可以和包括IgAl和IgA2的免疫球蛋白反应。欧洲人IgA缺乏者中有高达42%有抗IgA抗体，种族地域差异较大。若输入含有IgA的血液或血液制品，则会导致严重的免疫性输血反应，甚至威胁患者生命。还有部分IgA缺乏者产生的抗IgA抗体并不是输血和怀孕等免疫刺激产生的，当他们肌肉注射IgG后也会产生严重反应，这是由于许多免疫球蛋白制备时超过95%是IgG，但还是会混有一定量的IgA。并非只有IgA缺乏的人会产生抗IgA抗体，有很少部分血清IgA含量正常的献血者也会发现有特异性抗IgA抗体，这些抗体大多为抗IgAl和抗IgA2两个亚类,或同种异型(抗IgA2m⑴或抗IgA2m(2))两个亚类。抗IgA引起的输血后过敏反应轻重不一，重度可发生过敏性休克和死亡，严重威胁患者的生命。IgA输血过敏反应发生率大约为1:20，000-47，000，占输血相关性死亡的3.1%。我国近年来已有多篇关于抗IgA输血反应的报道。但至今,抗IgA过敏性输血反应发生率还没有可靠的评估，因为诊断未标准化，大多数严重过敏性输血反应患者缺乏实验室检查与随访。我国缺乏对IgA缺乏患者的检测、缺乏对IgA缺乏症患者体内是否含有抗IgA抗体的鉴定，更缺乏提供IgA阴性的血液或血液制品。所以目前我国IgA缺乏症患者，特别是体内含有抗IgA的患者输血存在很大风险。基于抗IgA抗体引起输血免疫反应的严重性，对于有过敏性输血反应病史和实验室确诊有抗IgA抗体的患者输血必须慎重，必须输注经确认的不含IgA抗原的血浆或血小板。若在紧急输血且无IgA阴性的血液或血液制品时,可考虑采用去除IgA (〈1.2Pg/ml)的静脉免疫球蛋白，或采用经多次洗涤后的红细胞，以减低IgA过敏反应再次发生的风险。中国专利文献CN101661035A公开了一种IgA缺乏者筛查试剂盒，由试剂和盒体构成，所述的试剂由样品稀释液、抗体稀释液、洗板液、封闭液、终止液、包被抗体、酶标二抗、人IgA抗原标准品、TMB组成，该发明的IgA的检测试剂盒可以应用于临床医疗单位及血站的常规血液检测，为IgA缺乏症患者减少输血风险，提高了输血的安全性。但是这一专利是用于检测患者或献血者血清中是否缺乏IgA抗原，而关于一种检测患者或献血者血清中是否含有抗IgA抗体的抗IgA抗体检测试剂盒目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种抗IgA抗体检测试剂盒。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:一种抗IgA抗体检测试剂盒，由试剂和盒体构成，所述的试剂放置在盒体中，所述的试剂由样品稀释液、包被缓冲液、洗板液、封闭液、显色液、终止液、包被抗原、酶标二抗、抗IgA ( + )标准品、阳性对照和阴性对照组成；所述的样品稀释液是磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的浓度在0.08 0.12 mol/L之间，磷酸盐缓冲液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，所述的聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯在磷酸盐缓冲液中的重量百分比在0.04 0.06%之间；所述的包被缓冲液是碳酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液的浓度在0.04 0.06 mol/L之间；所述的洗板液是磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的浓度在0.08 0.12 mol/L之间，磷酸盐缓冲液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，所述的聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯在磷酸盐缓冲液中的重量百分比在0.04
0.06%之间；所述的封闭液是磷酸盐缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液的浓度在0.08 0.12mol/L之间，磷酸盐缓冲液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯和牛血清白蛋白，所述的聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯在磷酸盐缓冲液中的重量百分比在0.04 0.06%之间，所述的牛血清白蛋白在磷酸盐缓冲液的重量百分比在0.1 1.0%之间；所述的显色液是磷酸酶底物缓冲液中，加入对硝基苯磷酸二钠，所述的对硝基苯磷酸二钠的浓度在0.5 2g/L之间；所述的终止液是氢氧化钠，所述的氢氧化钠的浓度在2 4mol/L之间；所述的包被抗原为定量人IgA,浓度为3-15mg/ml ;所述的酶标二抗是磷酸酶标记兔抗人抗体；所述的阴性对照为抗IgA抗体阴性血清，所述的阳性对照为抗IgA抗体阳性血清。所述的包被抗原，即IgA抗原标准品的制备方法包括以下步骤:
(1)将正常人血清rpm20000-30000，l-2h，4°c离心，并用 0.01M-0.05M pH 7.2-PH7.4PBS稀释1-2倍后通过protein G亲和柱进行亲和层析；0.0IM-0.05M pH 7.2-PH7.4 PBS缓冲液平衡约5-10倍柱床体积，大部分IgG吸附于柱上；
(2)0.3ml-0.8ml/min流速缓慢上样，收集穿过液,将其进行protein A亲和层析，0.01M-0.05M pH 7.2-PH7.4 PBS缓冲液平衡约5_10倍柱床体积；恒流泵控制洗脱流速，缓慢0.1M-0.5M pH 2.0-PH4.0甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱5_10倍柱床体积得到富含IgA的洗脱液；收集并用1- 1/10体积的1M-2M pH 8.0-PH10.0 Tris-HCl缓冲液中和；用
0.0IM-0.05M pH 7.2-PH7.4 PBS缓冲液平衡5-10倍柱床体积再生；
(3)将洗脱液通过superdex 200凝胶过滤，分部收集，测定OD28tl值选取峰值，即可除去杂质，得到纯化的IgA。所述的样品稀释液和洗板液的pH值在7-7.4之间。本发明优点在于:
1、本发明的抗IgA抗体的检测试剂盒可以用于临床医疗单位及血液中心、中心血站的常规血液检测，检测血液样品是否含有抗IgA抗体；
2、为患者提供输血服务，若患者体内含有抗IgA抗体，则提供临床合适的血液制品(SPIgA缺乏的血液制品)进行配合性输注，提高输血安全，减少输血风险。
附图1是96孔板反应格局。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。本发明是一种针对献血者和患者检测抗IgA抗体的检测试剂盒，特别是IgA缺乏者和自身免疫性疾病患者。所述的试剂盒由试剂和盒体构成，所述的试剂放置在盒体中。所述的试剂由样品稀释液、包被缓冲液、洗板液、封闭液、显色液、终止液、包被抗原、酶标二抗、抗IgA ( + )标准品、阳性对照和阴性对照组成。所述的样品稀释液是磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的浓度在0.08 0.12 mol/L之间，磷酸盐缓冲液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，所述的聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯在磷酸盐缓冲液中的重量百分比在0.04 0.06%之间；
所述的包被缓冲液是碳酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液的浓度在0.04 0.06 mol/L之
间；
所述的洗板液是磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的浓度在0.08 0.12 mol/L之间，磷酸盐缓冲液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，所述的聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯在磷酸盐缓冲液中的重量百分比在0.04 0.06%之间；
所述的封闭液是磷酸盐缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液的浓度在0.08 0.12 mol/L之间，磷酸盐缓冲液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯和牛血清白蛋白，所述的聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯在磷酸盐缓冲液中的重量百分比在0.04 0.06%之间，所述的牛血清白蛋白在磷酸盐缓冲液的重量百分比在0.1 1.0%之间；
所述的显色液是磷酸酶底物缓冲液中，加入对硝基苯磷酸二钠，所述的对硝基苯磷酸二钠的浓度在0.5 2g/L之间；
所述的终止液是氢氧化钠；
所述的氢氧化钠的浓度在2 4mol/L之间；
所述的包被抗原为定量人IgA (3-15mg/ml)；所述的酶标二抗是磷酸酶标记兔抗人抗体。所述的阴性对照为抗IgA抗体阴性血清，所述的阳性对照为抗IgA抗体阳性血清。在本试剂盒中，样品稀释液的作用是将样品血清1:100-1000稀释。包被缓冲液的作用是让包被抗原稳定吸附于微量反应板。洗板液的作用是将未结合的抗原、抗体及蛋白洗脱。封闭液的作用是封闭(blocking)固相上的空余间隙，防止结果假象的发生。包被抗原的作用是将抗原于微量反应板上；显色液的作用是使底物对硝基苯磷酸二钠经碱性磷酸酶催化后变色，使阳性孔变色为黄色。终止液的作用是终止碱性磷酸酶与对硝基苯磷酸二钠的催化作用，使反应液变为黄色。酶标二抗的作用一是与固相于微量板上特异性的抗原抗体复合物Fe端结合，二是是标记的碱性磷酸酶与底物催化反应，反应液变黄色。抗IgA(+ )标准品的作用是建立此实验的定量参比，所有样品与之比对定量。阳性对照的作用主要判断实验结果是否有效、稳定的依据。阴性对照的作用是不含有抗IgA的人血清，以指示待测样品的基准水平。本试剂盒的工作原理是:利用固定于酶标板上的IgA抗原决定簇和酶标二抗Fe端分别与样品中被检测抗体分子上Fe端结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗原和酶标抗体的量相对于待测抗体是过量的，因此复合物的形成量与待测抗体的含量成正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用与加入底物后生成的有色物质量(0D值)，即可确定待测抗体含量。本发明解决的技术难题:
1.本发明利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白A抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体抗IgA。抗原的纯度是影响实验结果的关键步骤。本发明将抗原两次纯化，以提高试验的特异性。特别是除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。试验中发生的假阳性反应，本发明用高速离心法(rpm20000-30000，l-2h，4°C )，将沉降系数大的来自人血浆或人体组织的抗原Ig去除，抗原中若含有与酶标抗人Ig反应的物质以及一些无关蛋白，也会因竞争吸附而影响包被效果，需去除。然后进行亲和层析，使IgA抗原高度纯化，彻底除去IgG、IgM的干扰，保证实验的特异性。2.患者或献血者血清中受检的特异性抗IgA只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在抗原包被后本发明用封闭液(含无关蛋白质:牛血清白蛋白)再包被一次，以封闭(blocking)固相上的空余间隙，防止假阴性结果的发生。3.过高的阴性本底影响结果的判断。本发明在检测过程中对待检样本血清先行稀释(1:40 1:200)，以避免本底的干扰。4.一些异种抗IgA抗体，像兔、山羊、绵羊、或小鼠来源的，链接碱性磷酸酶理论上都可以作为酶联免疫吸附测定的二抗。本发明选用市售商用单克隆兔抗人IgA (重链特异性)，二抗的浓度也是实验成败的关键。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体结合，固相载体上的酶量与标本中受检 抗体的量正相关。磷酸酶标记的兔抗人IgA过多或过少都将干扰实验的正确判读。本发明以不同梯度稀释二抗，寻找最佳反应浓度1:10(Γ1:1000，避免假阴性及假阳性的结果产生。需要说明的是，虽然中国专利文献CN101661035A公开了一种IgA缺乏者筛查试剂盒，可以应用于临床医疗单位及血站的常规血液检测，为IgA缺乏症患者减少输血风险，提高了输血的安全性。但是这一专利是用于检测患者或献血者血清中是否缺乏IgA抗原，若使用该筛查试剂盒检测出患者或献血员为IgA缺乏，则进一步地使用本发明的抗IgA抗体检测试剂盒检测有否抗体的存在，将为这一部分稀有血型人群的输血降低输血反应的风险。实施例1 IgA抗原标准品(包被抗原)的制备方法
1.将正常人血清 rpm20000-30000, l_2h，4°C离心，并用 0.0IM-0.05M pH 7.2-PH7.4PBS稀释1-2倍后通过protein G亲和柱进行亲和层析。0.01M-0.05M pH 7.2-PH7.4 PBS缓冲液平衡约5-10倍柱床体积，大部分IgG吸附于柱上。2.0.3ml-0.8ml/min流速缓慢上样,收集穿过液,将其进行protein A亲和层析，0.01M-0.05M pH 7.2-PH7.4 PBS缓冲液平衡约5_10倍柱床体积。恒流泵控制洗脱流速，缓慢0.1M-0.5M pH 2.0-PH4.0甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱5_10倍柱床体积得到富含IgA的洗脱液，其中可能还含有少量其他抗体成分(少量IgM和IgG等)。收集并用1- 1/10体积的 1M-2M pH 8.0-PH10.0 Tris-HCl 缓冲液中和。用 0.01M-0.05M pH 7.2-PH7.4 PBS 缓冲液平衡5-10倍柱床体积再生。3.将洗脱液通过superdex 200凝胶过滤,分部收集,测定OD28tl值选取峰值,即可除去杂质，得到纯化的IgA。IgA抗原标准品没有现成的市售商品，却是本实验的基本保障，是实验的关键第一步。虽然血清纯化有很多方法，亲和层析是一种手段。本发明采用二次亲和层析，先用protein G，再用protein A，纯化的IgA不含IgM和IgG，绝对避免因免疫球蛋白G、M、A竞争吸附而影响包被等检测实验效果。实施例2 实验步骤:
1.使用包被缓冲液将IgA抗原标准品稀释100-1000倍，每孔加入稀释后IgA IOOul0
4°C孵育过夜。2.用洗板液洗板4次。扣干后加入封闭液200ul/孔。37°C水浴30min后,再洗板3次扣干，4°C低温保存。平底板每孔加入经稀释的抗IgA ( + )标准品、阳性对照、阴性对照和待测血清100ul，37°C水浴I小时。待测血清重复4孔复本，对照重复2孔复本。3.将孔内液体甩干，使用洗板液洗板5次，扣干，每孔加入用稀释液100-1000倍稀释的酶标二抗IOOu 1，37°C水浴I小时。4.将孔内液体甩干，使用洗板液洗板5次，扣干，每孔加入显色液lOOul，
暗室反应15分钟,后加入终止液终止反应进行。5.酶标仪405nm读取结果。6.反应结果:96孔板反应格局(附图1)。样品f 13分别是13个测试者的待测血清样品。结果判读:
OD值>100%标准OD值为强阳性；
OD值在50 100%标准OD值之间为阳性；
OD值在15 50%标准OD值之间为弱阳性；
OD值〈15%标准OD值为阴性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种抗IgA抗体检测试剂盒，由试剂和盒体构成，所述的试剂放置在盒体中，其特征在于，所述的试剂由样品稀释液、包被缓冲液、洗板液、封闭液、显色液、终止液、包被抗原、酶标二抗、抗IgA ( + )标准品、阳性对照和阴性对照组成；所述的样品稀释液是磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的浓度在0.08 0.12 mol/L之间，磷酸盐缓冲液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，所述的聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯在磷酸盐缓冲液中的重量百分比在0.04 0.06%之间；所述的包被缓冲液是碳酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液的浓度在0.04 0.06 mol/L之间；所述的洗板液是磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液的浓度在0.08 0.12mol/L之间，磷酸盐缓冲液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯，所述的聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯在磷酸盐缓冲液中的重量百分比在0.04 0.06%之间；所述的封闭液是磷酸盐缓冲液，所述的磷酸盐缓冲液的浓度在0.08 0.12 mol/L之间，磷酸盐缓冲液中加入有聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯和牛血清白蛋白，所述的聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯在磷酸盐缓冲液中的重量百分比在0.04 0.06%之间，所述的牛血清白蛋白在磷酸盐缓冲液的重量百分比在0.1 1.0%之间；所述的显色液是磷酸酶底物缓冲液中，加入对硝基苯磷酸二钠，所述的对硝基苯磷酸二钠的浓度在0.5 2g/L之间；所述的终止液是氢氧化钠，所述的氢氧化钠的浓度在2 4mol/L之间；所述的包被抗原为定量人IgA，浓度为3_15mg/ml ；所述的酶标二抗是磷酸酶标记兔抗人抗体；所述的阴性对照为抗IgA抗体阴性血清，所述的阳性对照为抗I gA抗体阳性血清。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的包被抗原，即IgA抗原标准品的制备方法包括以下步骤: (1)将正常人血清rpm20000-30000，l-2h，4°C离心，并用 0.01M-0.05M pH 7.2-PH7.4PBS稀释1-2倍后通过protein G亲和柱进行亲和层析；0.0IM-0.05M pH 7.2-PH7.4 PBS缓冲液平衡约5-10倍柱床体积，大部分IgG吸附于柱上； (2)0.3ml-0.8ml/min流速缓慢上样，收集穿过液,将其进行protein A亲和层析，0.01M-0.05M pH 7.2-PH7.4 PBS缓冲液平衡约5_10倍柱床体积；恒流泵控制洗脱流速，缓慢0.1M-0.5M pH 2.0-PH4.0甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱5_10倍柱床体积得到富含IgA的洗脱液；收集并用1-1/10体积的1M-2M pH 8.0-PH10.0 Tris-HCl缓冲液中和；用0.0IM-0.05M pH 7.2-PH7.4 PBS缓冲液平衡5-10倍柱床体积再生； (3)将洗脱液通过superdex200凝胶过滤，分部收集，测定OD28tl值选取峰值，即可除去杂质，得到纯化的IgA。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的样品稀释液和洗板液的PH值在7-7.4之间。
全文摘要
本发明涉及一种抗IgA抗体检测试剂盒，由试剂和盒体构成，所述的试剂放置在盒体中，所述的试剂由样品稀释液、包被缓冲液、洗板液、封闭液、显色液、终止液、包被抗原、酶标二抗、抗IgA(+)标准品、阳性对照和阴性对照组成。本发明优点在于本发明的抗IgA抗体的检测试剂盒可以用于临床医疗单位及血液中心、中心血站的常规血液检测，检测血液样品是否含有抗IgA抗体；为患者提供输血服务，提供合适的血液制品进行配合性输注，提高输血安全，减少输血风险。
文档编号G01N33/53GK103197053SQ20131008382
公开日2013年7月10日 申请日期2013年3月15日 优先权日2013年3月15日
发明者陆萍, 凌冰, 李睿书, 刘达庄 申请人:上海市血液中心