耐高渗透压的重组大肠杆菌及其应用
【专利说明】耐高渗透压的重组大肠杆菌及其应用 发明领域
[0001] 本发明涉及通过遗传工程改造大肠杆菌的领域。具体而言，本发明提供了一种含 有突变的rpoB、cusS和/或mreC基因的重组大肠杆菌。本发明还涉及使用所述大肠杆菌 用于生产如丁二酸等化工原料的用途。本发明还提供了使用所述大肠杆菌生产丁二酸等化 工原料的方法，以及通过引入突变的rpoB、cusS和/或mreC基因而提高大肠杆菌耐渗透压 能力的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 微生物细胞的生理性能是微生物工程菌发酵的核心问题之一。良好的微生物工 程菌需要具备以下生理特性：耐受高浓度的葡萄糖、耐受高浓度的产物、耐受高温和耐受低 pH〇
[0004] 微生物细胞为了生存和生长，胞质内的渗透压保持在280-320mosM，平均为 300mosM 左右（Higgins et al. 1987, Trends Biochem Sci 12:339-344)。当培养基溶液的渗 透压高于320mosM，细胞会发生收缩产生质壁分离现象。细胞生长减慢，在低生长速率情 况下，大部分的基因会停止表达。大肠杆菌细胞同时会启动渗透压调节机制：吸收K+，积 累脯氨酸，合成海藻糖，甜菜碱等两性离子化合物等；细胞外膜组分蛋白OmpC的合成增加 (Postma et al. 1996, Escherichia coli and Salmonella, 2rd: 1210-1224)。此外，在高渗透 压条件下（23g/L NaCl，渗透压相当于800mosM)，还有40个基因表达上调，107个基因表达 下调（Weber et al. 2002, J Bacteriol 184:5502-5507)，这些基因的表达是否和渗透压调节 相关还有待鉴定。
[0005] 通过适应性进化可以提高菌株对高渗透压的耐受性，提高工程菌株的产量和产 率。Liu 等（Liu et al. 2007, Biotechnol Bioeng97:825-832)在 70g/l (渗透压相当于 2392mosM)的NaCl中连续培养光滑球拟酵母，筛选得到耐高渗透压的突变株RS23。相 对于野生型，突变株RS23丙酮酸的产量和产率增长41. 1%和11. 1%。Fang等（Fang et al. 2011，World JMicrobiol Biotechnol27:3009-3013)采用相同的手段，在 42g/l (渗透 压相当于1436mosM)的NaCl中连续培养琥珀酸放线杆菌，筛选得到耐高渗透压的突变株 CH050。相对于野生型，突变株CH050 丁二酸的产量和产率增长了 37. 5%和4. 37%。但是，这 些研究对菌株耐高渗透压的基因及相关机制并没有进行解析。
[0006] 用无机盐培养基发酵常常需要葡萄糖作为碳源，在一定范围内，目标产物的产量 会随着葡萄糖浓度的增加而增加。但若葡萄糖浓度过高，由于渗透压过大，将影响菌株的生 长和代谢。另外，用中性PH进行有机酸发酵时，发酵产物有机酸盐会导致高渗透压，对细胞 生长和代谢产生抑制作用。因此，微生物工程菌株对渗透压的耐受性尤为重要。
[0007] 发明概述
[0008] 在一个方面，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其含有选自如下的一种或多种突 变的基因：（a)突变的rpoB基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列 的位置D654的位置上含有修饰；(b)突变的cusS基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列的位置G210的位置上含有修饰；和（c)突变的mreC基因，其所编码 的多肽在对应于SEQ ID No. :3所示氨基酸序列的位置G24的位置上含有修饰。
[0009] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述突变的rpoB基因所编码的多 肽在对应于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列的位置D654的位置上是用Y置换D。
[0010] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述突变的cusS基因所编码的多 肽在对应于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列的位置G210的位置上是用V置换G。
[0011] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述突变的mreC基因所编码的多 肽在对应于SEQ ID No. : 3所示氨基酸序列的位置G24的位置上是用D置换G。
[0012] 在一个实施方案中，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其含有如下的一种或多种 突变的基因：（a)突变的rpoB基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No. : 4所示核苷酸序列的 位置G1960的位置上含有修饰；(b)突变的cusS基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No. : 5 所不核苷酸序列的位置G629的位置上含有修饰；和（c)突变的mreC基因，其核苷酸序列在 对应于SEQ ID No. : 6所示核苷酸序列的位置G71的位置上含有修饰。
[0013] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述突变的rpoB基因的核苷酸序 列在对应于SEQ ID No. : 4所示核苷酸序列的位置G1960的位置上是用T置换G。
[0014] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述突变的CUsS基因的核苷酸序 列在对应于SEQ ID No. : 5所示核苷酸序列的位置G629的位置上是用T置换G。
[0015] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述突变的mreC基因的核苷酸序 列在对应于SEQ ID No. : 6所示核苷酸序列的位置G71的位置上是用A置换G。
[0016] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中还含有如下修饰：磷酸烯醇式丙酮 酸-糖磷酸转移酶系统（PTS)中所涉及的一或多个基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙 酮酸-糖磷酸转移酶系统（PTS)中所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制；PflB和/或 adhE基因表达的抑制、和/或pflB和/或adhE基因所编码的蛋白质活性的抑制；IdhA基 因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因和/或外源gif基 因表达的增强、和/或galP基因和/或外源gif基因所编码的蛋白质活性的增强；和pck 基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
[0017] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中的磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移 酶系统（PTS)中所涉及的一或多个基因的表达被抑制或者其所编码的蛋白质的活性被抑 制，其中所述一或多个基因是选自如下的一或多个基因：编码PTS系统酶I的基因 ptsl、编 码PTS系统酶Hpr的基因 ptsH、编码PTS系统酶IIAele的基因 err和编码PTS系统酶IICBele的基因 ptsG。
[0018] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中还含有如下的修饰：pta基因和 ackA基因表达的抑制、和/或pta基因和ackA基因所编码的蛋白质活性的抑制；和aceA基 因、aceB基因和dcuC基因表达的增强、和/或aceA基因、aceB基因和dcuC基因所编码的 蛋白质活性的增强。
[0019] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中还含有如下修饰：mgsA基因表达的 抑制、和/或mgsA基因所编码的蛋白质活性的抑制。
[0020] 在第二个方面，本发明提供了生产丁二酸的方法，所述方法包括：(a)发酵培养本 发明的重组大肠杆菌；和（b)收获产生的丁二酸；以及任选地分离或纯化所述丁二酸。
[0021] 在一个实施方案中，本发明生产丁二酸的方法中，发酵培养本发明的重组大肠杆 菌的步骤包括使用高浓度的葡萄糖和/或高浓度丁二酸盐。
[0022] 在第三个方面，本发明提供了使用本发明的重组大肠杆菌以用于生产丁二酸的用 途。
[0023] 在第四个方面，本发明提供了提高大肠杆菌耐渗透压能力的方法，所述方法包括 在大肠杆菌中引入选自如下的一种或多种突变的基因：(a)突变的rpoB基因，其所编码的 多肽在对应于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列的位置D654的位置上含有修饰；(b)突变的 cusS基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列的位置G210的位置上 含有修饰；和（c)突变的mreC基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. : 3所示氨基酸序 列的位置G24的位置上含有修饰。
[0024] 在一个实施方案中，本发明的方法中所述突变的rpoB基因所编码的多肽在对应 于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列的位置D654的位置上是用Y置换D。
[0025] 在一个实施方案中，本发明的方法中所述突变的cusS基因所编码的多肽在对应 于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列的位置G210的位置上是用V置换G。
[0026] 在一个实施方案中，本发明的方法中所述突变的mreC基因所编码的多肽在对应 于SEQ ID No. : 3所示氨基酸序列的位置G24的位置上是用D置换G。
[0027] 附图简述
[0028] 图I : (A)野生型rpoB基因以及突变的rpoB基因（rpoB*)所编码的多肽的氨基酸 序列（分别为SEQ ID No. : 1 (野生型）和SEQ ID No. : 7 (突变的））比对；（B)野生型rpoB 基因（SEQIDNo. :4)以及突变的rpoB基因（rpoB*)(SEQIDNo. :10)的核苷酸序列比对。
[0029] 图2 : (A)野生型cusS基因以及突变的cusS基因（cusS*)所编码的多肽的氨基酸 序列（分别为SEQ ID No. :2(野生型）和SEQ ID No. :8(突变的））比对；（B)野生型cusS 基因 （SEQ ID No. : 5)以及突变的cusS基因（cusS*) (SEQ ID No. : 11)的核苷酸序列比对。
[0030] 图3 : (A)野生型mreC基因以及突变的mreC基因（mreC*)所编码的多肽的氨基酸 序列（分别为SEQ ID No. :3(野生型）和SEQ ID No. :9(突变的））比对；（B)野生型mreC 基因（SEQIDNo. :6)以及突变的mreC基因（mreC*)(SEQIDNo. :12)的核苷酸序列比对。
[0031] 图4 :野生型大肠杆菌ATCC8739在含5%、20%和25%葡萄糖的无机盐培养基中的 生长曲线。
[0032] 图 5 : (A)野生型大肠杆菌 ATCC8739 和突变株 MX-202 (ATCC8739, rpoB*)、MX-204 (ATCC8739, cusS*)、MX-206(ATCC8739，mreC*)在含20%葡萄糖的无机盐培养基中的生长曲 线。⑶野生型大肠杆菌ATCC8739和突变株MX-202、MX-204、MX-206在含25%葡萄糖的无 机盐培养基中的生长曲线。
[0033] 图6 :大肠菌株野生型ATCC8739在含不同浓度丁二酸二钠培养基中的生长曲线。
[0034] 图 7 : (A)野生型大肠杆菌 ATCC8739 和突变株 MX-202 (ATCC8739, rpoB*)、 MX-204 (ATCC8739, cusS*)、MX-206(ATCC8739，mreO)含 43g/L 丁二酸二钠培养基中的 生长曲线。（B)野生型大肠杆菌ATCC8739和突变株MX-202 (ATCC8739, rpoB*)、MX-204 (ATCC8739, cusS*)、MX-206(ATCC8739,mreO)含 86g/L 丁二酸二钠培养基中的生长曲线。
[0035] 发明详述
[0036] 除非另有说明，所有技术和科学术语都具有本领域所知的常见含义。所有专利、专 利申请、公开出版物、序列、以及其他公开材料均援引加入本文，除非另有说明。
[0037] 在一个方面，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其含有选自如下的一种或多种突 变的基因：（a)突变的rpoB基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列 的位置D654的位置上含有修饰；(b)突变的cusS基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列的位置G210的位置上含有修饰；和（c)突变的mreC基因，其所编码 的多肽在对应于SEQ ID No. : 3所示氨基酸序列的位置G24的位置上含有修饰。
[0038] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中同时含有2种所述突变的基因。在 一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中同时含有3种所述突变的基因。
[0039] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中含有如下突变的基因：(a)突变的 rpoB基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列的位置D654的位置上 含有修饰；和（b)突