变的cusS基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序 列的位置G210的位置上含有修饰。
[0040] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中含有如下突变的基因：(a)突变的 rpoB基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列的位置D654的位置上 含有修饰；和（c)突变的mreC基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. : 3所示氨基酸序 列的位置G24的位置上含有修饰。
[0041] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中含有如下突变的基因：(b)突变的 cusS基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列的位置G210的位置上 含有修饰；和（c)突变的mreC基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. : 3所示氨基酸序 列的位置G24的位置上含有修饰。
[0042] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中含有如下突变的基因：(a)突变的 rpoB基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列的位置D654的位置上 含有修饰；(b)突变的cusS基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列 的位置G210的位置上含有修饰；和（c)突变的mreC基因，其所编码的多肽在对应于SEQ ID No. : 3所示氨基酸序列的位置G24的位置上含有修饰。
[0043] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述突变的rpoB基因所编码的多 肽在对应于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列的位置D654的位置上是用Y置换D。
[0044] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述突变的cusS基因所编码的多 肽在对应于SEQ ID No. : 2所示氨基酸序列的位置G210的位置上是用V置换G。
[0045] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述突变的mreC基因所编码的多 肽在对应于SEQ ID No. : 3所示氨基酸序列的位置G24的位置上是用D置换G。
[0046] 本发明的重组大肠杆菌中所述的突变的基因的增加了丁二酸的产量和产率，和/ 或所述突变的基因增加了该重组大肠杆菌对于葡萄糖的耐受性和/或丁二酸盐的耐受性。 另外，本发明的重组大肠杆菌中所述的突变的基因之间还具有协同效应、和/或加合效应。
[0047] 在本发明的实施方案中，对应的位置是通过与相应的序列进行序列比对而确定 的。例如，对应于SEQ ID No. : 1所示氨基酸序列的位置D654的位置，是通过与SEQ ID No. : 1 所示氨基酸序列进行序列比对而确定的对应于SEQ ID No. : 1中D654的位置。
[0048] 术语"突变"具有本领域内常用的含义，是指在核苷酸序列中插入、添加、缺失、或 者置换一或多个核苷酸，或者是指在多肽序列中插入、添加、缺失、或者置换一或多个氨基 酸。
[0049] 在一个实施方案中，本发明提供了一种重组大肠杆菌，其含有如下的一种或多种 突变的基因：（a)突变的rpoB基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No. : 4所示核苷酸序列的 位置G1960的位置上含有修饰；(b)突变的cusS基因，其核苷酸序列在对应于SEQ ID No. : 5 所不核苷酸序列的位置G629的位置上含有修饰；和（c)突变的mreC基因，其核苷酸序列在 对应于SEQ ID No. : 6所示核苷酸序列的位置G71的位置上含有修饰。
[0050] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述突变的rpoB基因的核苷酸序 列在对应于SEQ ID No. : 4所示核苷酸序列的位置G1960的位置上是用T置换G。
[0051] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述突变的CUsS基因的核苷酸序 列在对应于SEQ ID No. : 5所示核苷酸序列的位置G629的位置上是用T置换G。
[0052] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述突变的mreC基因的核苷酸序 列在对应于SEQ ID No. : 6所示核苷酸序列的位置G71的位置上是用A置换G。
[0053] 如本文所用，rpoB基因 （Genbank No. ACA79637. 1)编码RNA聚合酶β亚基。在本 发明的一个实施方案中，所使用的初始大肠杆菌菌株中的野生型rpoB基因的核苷酸序列 如SEQ IDNo. :1所示，其所编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No. :4所示。在一个实施方案 中，本发明的重组大肠杆菌中所包含的突变的rpoB基因含有对应于如下突变：G1960T (参 见图1B);而所述突变的rpoB基因所编码的多肽具有对应于如下突变的一个氨基酸置换： D654Y(参见图 1A)。
[0054] 如本文所用，cusS基因 （Genbank No. ACA79044. 1)编码双元调控组氨酸激酶（EC No:2. 7. 13. 3)。在本发明的一个实施方案中，所使用的初始大肠杆菌菌株中的野生型cusS 基因的核苷酸序列如SEQ ID No. :2所示，其所编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No. :5所 示。在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中所包含的突变的cusS基因含有对应于如下突 变：G629T (参见图2B);而所述突变的cusS基因所编码的多肽具有对应于如下突变的一个 氨基酸置换：D210V(参见图2A)。
[0055] 如本文所用，mreC基因 （Genbank No. ACA76134. 1)编码杆状决定蛋白。在本发明 的一个实施方案中，所使用的初始大肠杆菌菌株中的野生型mreC基因的核苷酸序列如SEQ ID No. : 3所示，其所编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID No. : 6所示。在一个实施方案中， 本发明的大肠杆菌中所包含的突变的mreC基因含有对应于如下突变：G71A(参见图3B); 而所述突变的mreC基因所编码的多肽具有对应于如下突变的一氨基酸置换：G24D (参见图 3A)。
[0056] 在一个实施方案中，所述突变的rpoB基因编码的多肽序列包含SEQ ID No. : 7所示 序列。在一个实施方案中，所述突变的rpoB基因序列包含SEQ ID No. : 10所示序列。
[0057] 在一个实施方案中，所述突变的cusS基因编码的多肽序列包含SEQ IDNo. : 8所示 序列。在一个实施方案中，所述突变的cusS基因序列包含SEQ ID No. : 11所示序列。
[0058] 在一个实施方案中，所述突变的mreC基因编码的多肽序列包含SEQ ID No. : 9所示 序列。在一个实施方案中，所述突变的mreC基因序列包含SEQ ID No. : 12所示序列。
[0059] 在一个实施方案中，所述突变的基因的表达可以被增强、或者抑制。
[0060] 如本文所用，术语"基因表达增强"，其具有本领域内熟知的含义，是指基因表达强 度的增强，并导致基因转录后产生的mRNA数量的增加。基因表达增强可以通过如下方式 实现，例如但不限于：在基因前引入强启动子、增加基因的拷贝数、或者增强mRNA的稳定性 等。如本文所用，术语"基因所编码的蛋白活性增强"具有本领域内熟知的含义，是指基因 转录翻译后产生的蛋白活性的增加。其可以例如通过基因表达强度的增强、增加酶在细胞 中的含量、氨基酸位点的突变来实现。实现"基因的表达增强"以及"基因所编码的蛋白质 的活性增强"的各种技术手段是本领域技术人员熟知的。
[0061] 在本发明中，基因表达增强可以例如通过引入强启动子来实现。在本发明的一 些实施方案中，使用的强启动子例如是：Ppck*(SEQ ID No. :13) (Zhang et al.，2009，Appl Environ Microbiol75:7807-7813)、M1-37(SEQ ID No. :14)、或M1-93(SEQ ID No. :15) (Lu et al.，2012, Appl Microbiol Biotechnol93:2455-2426)。
[0062] 在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述的突变的基因可以位于质粒 中。在一个实施方案中，本发明的重组大肠杆菌中所述的突变的基因可以位于染色体中。 [0063] 如本文所用，术语"质粒"具有本领域熟知的定义，其是以附加体形式存在于细 胞中的非染色体DNA并且能够自主复制的DNA分子。本发明中可以使用的质粒例如有： pEASY-Blunt 和 pKD46 等。
[0064] 如本文所用，术语"染色体"具有本领域熟知的定义。在一些实施方案中，本发明 所涉及的经修饰的基因位于染色体中。将经修饰的基因整合至染色体的技术是本领域技术 人员熟知的，例如可以参见 Michael R. Green 和 Joseph Sambrook 的〃Molecular Cloning:A Laboratory Manual"（Fourth Edition) 〇
[0065] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰：磷酸烯 醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（PTS)所涉及的一或多个基因表达的抑制、和/或磷酸烯 醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（PTS)所涉及的基因所编码的蛋白质活性的抑制；PflB基 因表达的抑制、和/或PflB所编码的蛋白质活性的抑制；IdhA基因表达的抑制、和/或IdhA 基因所编码的蛋白质活性的抑制；galP基因和/或外源gif基因表达的增强、和/或galP 基因；和pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
[0066] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统 (PTS)所涉及的一或多个基因表达的抑制、和/或磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统 (PTS)中所涉及的一或多个基因所编码的蛋白质活性的抑制，其中所述一或多个基因是选 自如下的一或多种基因：编码PTS系统酶I的基因 ptsl、编码PTS系统酶Hpr的基因 ptsH、 编码PTS系统酶IIAelc;的基因 err和编码PTS系统酶IICBek的基因 ptsG。
[0067] 在本发明中，ptsl 基因 （GenBank No:ACA76928. 1、NC_010468. 1)编码一种磷 酸转移酶，其被称为磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶I (EC N〇:2. 7. 3. 9)。ptsH基因 (GenBank No:ACA76929. 1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶Hpr (EC No:2. 7. L 69)。 err基因 （GenBank No:ACA76927.1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶IIAGlc (EC No: 2. 7. 1. 69)。ptsG基因 （GenBank No:ACA78131. 1)编码磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移 酶 IICBGlc (EC No: 2. 7. L 69)。
[0068] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下的一或多种修饰：ptsl基 因表达的抑制、和/或PtsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；pfIB基因表达的抑制、和/ 或PflB基因所编码的蛋白质活性的抑制；IdhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的 蛋白质活性的抑制；galP基因表达的增强、和/或galP基因所编码的蛋白质活性的增强； 和pck基因表达的增强、和/或pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
[0069] 在一个实施方案中，本发明的大肠杆菌还含有选自如下修饰：ptsl基因表达的抑 制、和/或PtsI基因所编码的蛋白质的活性抑制；pf IB基因表达的抑制、和/或pflB所编 码的蛋白质活性的抑制；IdhA基因表达的抑制、和/或IdhA基因所编码的蛋白质活性的抑 制；galP基因表达的增强、和/或galP基因所编码的蛋白质活性的增强；和pck基因表达 的增强、和/或Pck基因所编码的蛋白质活性的增强。
[0070] 在本发明中，pf IB基因 （GenBank No: ACA78322. 1)编码丙酮酸甲酸裂解酶 (Pyruvate formate lyase) (EC No:2. 3. 1. 54)。IdhA 基因 （GenBank No:ACA77176.1)编 码乳酸脱氢!酶 A (lactate dehydrogenase A) (EC No: I. I. 1. 28)。galP 基因 （GenBank No:ACA76443. 1)编码半乳糖MFS转运蛋白。pck基因（GenBankNo:ACA75988. 1)编码磷酸 烯醇式丙酮酸羧化激酶，又称作PCK酶（EC No :4. I. 1. 49)。
[0071] 如本文所用，术语"基因表达的抑制"具有本领域内熟知的含义，是指基因表达强 度的降低，从而导致基因转录后产生的mRNA数量的减少。基因表达的抑制可以通过如下方 式实现，例如但不限于：基因的敲除、减少基因