及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫学及基因工程领域，具体地说，涉及一种马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2及其制备方法。
【背景技术】
[0002]根据对2013年春季出现的H7N9新亚型流感病毒进行病毒分子遗传背景分析的结果，在H7N9亚型流感病毒的8个基因片段中，H7片段与浙江鸭群中分离的禽流感病毒相似，往上追溯，又与东亚地区野鸟中分离的禽流感病毒基因相似；N9片段与东亚地区野鸟中分离的禽流感病毒相似。其余6个基因片段(PB2、PB1、PA、NP、M、NS)与H9N2禽流感病毒相似，且H9N2禽流感病毒来源于中国上海、浙江、江苏等地的鸡群。
[0003]H7N9流感病毒属于基因组为单股、正链、8节段的正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒成员，A型流感病毒囊膜表面糖蛋白血凝素(HA)包括16种、神经氨酸酶(NA)包括9种，它们之间的不同组合，导致新亚型不断出现，迄今为止已发现130余种，因此，当新亚型流感突发时，现有的预防、治疗措施很难跟上。
[0004]尽管疫苗是防控流感病毒的有效方法，但流感病毒的高度变异特性，导致疫苗的研发与生产相对滞后；目前临床应用的抗流感病毒药物，如M2离子通道抑制剂(金刚烷胺和金刚乙胺)、神经氨酸酶抑制剂(帕拉米韦、奥司他韦和扎那米韦)等存在保护效率低、耐药性及严重副作用等问题，特别是其发挥有效的治疗作用需要在感染早期即能诊断并使用，因此，临床作用还很有限。
[0005]近年来，禽流感病毒感染恢复者血清和抗禽流感中和抗体已在病人救治及动物模型攻毒保护方面显示出良好的效果。中和抗体在新发传染病早期，没有疫苗的紧急情况下，即可作为预防性药物接种免疫力低下的人群增强抗病力，也可作为治疗性药物应用于早期确诊病人，甚至能用于重症肺炎，挽救重症患者的生命，降低致死率。
[0006]在各类研发的中和抗体中，以动物高免血清制备的多克隆抗体、抗病毒免疫球蛋白以及精制抗病毒免疫球蛋白F(ab’)2等一系列产品，具有来源广、制备周期短、成本低、效价高等优势。高免血清用于抗病毒治疗在临床上应用多年，已纳入我国生物制品规程获批准生产的，包括抗狂犬病毒高免血清、抗巨细胞病毒多克隆抗体等14种产品。但高免动物血清有一定致敏性，保存时间短等缺点，如何脱敏，提高血清制品质量是亟待解决的问题。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种高效、安全、可靠的马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2及其制备方法。
[0008]为了实现本发明目的，本发明提供的马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’ )2的制备方法，将H7N9亚型流感病毒株A/shanghai2/2013的病毒灭活液与免疫佐剂混合作为免疫原，通过多次免疫健康马匹，获得高免血浆，分离纯化IgG蛋白，经胃蛋白酶酶切，将酶切产物过Protein G琼脂糖凝胶柱，收集流穿液，经超滤浓缩后，即得马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2。
[0009]具体地，上述方法包括以下步骤:
[0010]I)将H7N9亚型流感病毒株A/shanghai2/2013接种7-9日龄SPF鸡胚，37°C孵育72h，收获鸡胚尿囊液，用甲醛37°C灭活72h，灭活病毒接种7-9日龄SPF鸡胚，盲传3代，3代鸡胚尿囊液中均检不出病毒为灭活合格；收获鸡胚尿囊液，4°C离心，沉淀用PBS溶解后，进行蔗糖密度梯度离心，获得纯化浓缩的H7N9亚型流感病毒灭活液；
[0011]2)将上述病毒灭活液与弗氏完全佐剂混合，马经过背部皮下分点注射的方法进行初免、多次加强免疫，检测马血浆效价达到1:5000以上时，采血；采用饱和硫酸铵沉淀法，分离纯化IgG蛋白，然后用胃蛋白酶进行酶切；
[0012]3)将酶切产物过Protein G琼脂糖凝胶柱，收集流穿液，经超滤浓缩后，即得马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2。
[0013]其中，步骤2)中病毒灭活液与弗氏完全佐剂按1:2的体积比混合。
[0014]步骤2)中所述饱和硫酸铵沉淀法具体为:a)将I体积血浆与2体积无热原水混合后，加入3体积的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，使溶液中硫酸铵浓度达到50%，全部加入后于室温静置30-40min，5000rpm离心20min，弃上清；b)取沉淀用2体积无热原水重悬，加入I体积的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，使溶液中硫酸铵浓度达到33.3%，全部加入后于室温静置30-40min，5000rpm离心20min，取沉淀；重复b) 2-3次，获得纯化的IgG蛋白。
[0015]步骤3)中使用的亲和层析柱中填料为Sepharose 4B。洗脱亲和层析柱时使用的洗脱缓冲液成分为:pH2.71mM Tris-HCl。洗脱后用IM Tris中和。
[0016]本发明还提供按照上述方法制备的马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2。
[0017]本发明还提供所述马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2在制备用于预防和/或治疗H7N9亚型流感药物中的应用。
[0018]本发明还提供由所述马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2制备的用于预防和/或治疗H7N9亚型流感的药物。
[0019]本发明中制备的免疫球蛋白F(ab’)2含量不低于总蛋白含量的95.0%。本发明产品为冻干粉剂型，具有高效价的中和H7N9亚型流感病毒特异性，可成为治疗H7N9病人的一种新的有效药物，用于H7N9亚型流感感染患者的紧急救治。
[0020]本发明提供的马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2，是用于预防和治疗H7N9亚型流感病毒所引起的重症肺炎型H7N9流感的有效药物，对H7N9亚型流感病毒感染重症患者具有显著疗效，提高患者的存活率。本品将填补国内此类药物空白。本发明的制备工艺采用独特的工艺参数控制，用常规的分离法生产出所述特异性免疫球蛋白，适于工业化生产，产品安全可靠。用于制备马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)d^原料血浆有稳定高效的来源，能满足血浆的供给。
【具体实施方式】
[0021]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0022]实施例1马抗H7N9亚型流感特异免疫球蛋白F(ab’)2的制备方法
[0023]所述制备方法包括以下步骤:
[0024]1、将H7N9亚型流感病毒株A/shanghai2/2013接种7-9日龄SPF鸡胚，37°C孵育72h，收获鸡胚尿囊液，用甲醛37°C灭活72h，灭活病毒接种7-9日龄SPF鸡胚，盲传3代，3代鸡胚尿囊液中均检不出病毒为灭活合格；收获鸡胚尿囊液，4°C 5000g离心后，4°C 10000g离心2h，沉淀用灭菌PBS溶解后，进行蔗糖密度梯度离心(用20%、30%、60%蔗糖密度梯度离心后，可以在30%和60%之间得到纯化的流感病毒)，获得纯化浓缩的H7N9亚型流感病毒灭活液。
[0025]2、将上述病毒灭活液与弗氏完全佐剂、弗式不完全佐剂按1:2的体积比混合均匀，马(挑选健康马，优选4-6岁体质健康的马匹，按照《中国生物制品规程》中，生物制品生产用马匹检疫及管理规程进行检疫和管理)经过背部皮下分点注射的方法进行初免、多次加强免疫，检测马血浆效价达到1:5000以上时，采血。
[0026]3、采用饱和硫酸铵沉淀法，分离纯化IgG蛋白:
[0027]①无菌条件下，将I体积血浆与2体积无热原水混合后，加入3体积的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，使溶液中硫酸铵浓度达到50%，全部加入后于室温静置30-40min，5000rpm离心20min，弃上清。
[0028]②取沉淀用2体积无热原水重悬，加入I体积的饱和硫酸钱溶液，边加边搅拌，使溶液中硫酸铵浓度达到33.3%，全部加入后于室温静置30-40min，5000rpm离心20min，取沉淀；重复b) 2-3次，获得纯化的IgG蛋白。
[0029]4、用胃蛋白酶酶切纯化的IgG蛋白。具体为:向10mL马血清中加入2倍体积的除热源的水后，用NaOH调pH到3.3-3.4，加入终浓度为10000IU/mL的胃蛋白酶，混匀。于30°C，消化2.5h。消化后样品保存于_80°C。
[0030]5、将酶切产物过Protein G琼脂糖凝胶柱，