大豆GmNEK1蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及大豆GmNEKI蛋白及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 环境中物理、化学因素的变化，例如干旱、盐碱、冷害、冻害、水涝等胁迫因素以及 生物因素，例如病虫害对植物的生长发育具有重要的影响，严重时会造成农作物大规模减 产，培育耐逆性作物是种植业的主要目标之一。提高作物的耐逆性，除了利用传统的育种方 法，目前，分子遗传育种已经成为科技工作者所关注的领域之一。在非生物和生物逆境的胁 迫下，高等植物细胞有多种途径感受和应答外界环境中物化参数的变化，将胞外的信号变 为胞内信号，经过一系列磷酸化级联反应将信号传递到细胞核，经转录因子调控相关的功 能基因，启动逆境应答基因的表达，提高植物的耐逆性。
【发明内容】
[0003] 本发明的一个目的是提供大豆GmNEKI蛋白及其编码基因。
[0004] 本发明提供的蛋白，是如下（a)或（b):
[0005] (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0006] (b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。
[0007] 上述蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多 于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0008] 编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。
[0009] 上述DNA分子是如下（1)-(4)中任一种的DNA分子：
[0010] (1)编码区为序列表中的序列1所示的DNA分子；
[0011] (2)编码区为序列表中序列1自5'末端第1-1827位核苷酸所示的DNA分子；
[0012] (3 )在严格条件下与（1)或（2 )限定的DNA序列杂交且具有相同功能的蛋白的DNA 分子；
[0013] (4)与（1)或（2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少 具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具 有99%同源性且具有相同功能的DNA分子。
[0014] 上述严格条件为在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0? 1%SDS 和 1 X SSC，0? 1%SDS 各洗膜一次。
[0015] 含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护 的范围。
[0016] 上述重组载体为将上述DNA分子插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载 体。
[0017] 在本发明的实施例中，表达载体为PBIN438,重组载体为将序列表序列1自5'末端 第1-1827位核苷酸插入pBIN438植物表达载体的BamHI和Kpnl酶切位点之间得到的重组 载体。
[0018] 扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围，具体如 下：
[0019] NEK1-F 5' CGCGGATCCATGGAGCAGTACGAAATTCTAGAAC 3'
[0020] NEK1-R 5'CGGGGTACCGGCCACAGTTTCCTTGAAGCTCT3'
[0021] 上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控 植物耐逆性、调控植物生物量和/或调控植物籽粒产量中的应用也是本发明保护的范围；
[0022] 所述调控植物耐逆性为提高植物耐逆性；
[0023] 所述调控植物生物量为提高植物生物量；
[0024] 所述调控植物籽粒产量为提高植物籽粒产量。
[0025] 所述耐逆性具体为耐盐性、耐旱性和/或耐低温；
[0026] 所述生物量具体通过叶宽和/或叶长体现。
[0027] 所述植物具体为双子叶植物或单子叶植物。
[0028] 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0029] 本发明提供的方法，为将编码上述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植 物，所述转基因植物具有如下1) _3)中至少一种特征：
[0030] 1)所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物；
[0031] 2)所述转基因植物的生物量高于所述目的植物；
[0032] 3)所述转基因植物的籽粒产量高于所述目的植物。
[0033] 上述方法中，所述耐逆性为耐盐性、耐旱性和/或耐低温；
[0034] 所述生物量通过叶宽和/或叶长体现；
[0035] 所述编码上述蛋白的DNA分子通过上述的重组载体导入目的植物。
[0036] 上述方法中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。
[0037]上述低温为_6°C，上述生物量为单株生物量，上述籽粒产量通过9株籽粒重体现。
[0038] 可用现有的植物表达载体构建含有GmNEKl基因的重组表达载体。
[0039] 所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植 物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的 3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导（Ti)质粒基因（如胭脂合成酶Nos基因）、植物基因(如大豆贮 存蛋白基因）3'端转录的非翻译区均具有类似功能。
[0040] 使用GmNEKl构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种 增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子 (Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构 建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以 是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整 个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可 以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0041] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、 萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗 化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性 标记基因,直接以逆境筛选转化植株。
[0042] 本发明基因可通过如下方式导入宿主中：将本发明基因插入表达盒中，再将表达 盒通过植物表达载体、非致病自我复制的病毒或弄杆菌导入宿主。携带本发明基因的表达 载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介 导等常规生物学方法转化植物细胞或组织。
[0043] 本发明的实验证明，本发明发现了大豆GmNEKl蛋白及其编码基因，并通过转基因 实验，验证该蛋白及其基因具有提高植物生物量、籽粒产量及耐逆性功能，转入本发明基因 的植物的生物量、籽粒产量和耐逆性明显高于野生型受体植物，如转基因拟南芥，经过盐、 干旱或低温处理后，转基因植物的恢复情况明显好于野生型拟南芥，且存活率、抽薹率等都 较对照组有显著提高。同时，转入本发明基因的转基因植物的每株生物量和籽粒总产量也 明显高于对照，过量表达本发明所述基因的各转基因株系其耐旱、耐盐和耐低温性及单株 生物量和籽粒产量均与转基因植株中本发明所述基因的表达量呈正相关，进一步表明本发 明所述蛋白及其编码基因对培育耐逆且高产植物品种，特别是培育耐非生物胁迫如耐干旱 和/或耐盐和/或耐低温且高产植物品种，从而提高农作物产量具有重要意义。因此，本发 明蛋白及其编码基因有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0044] 图1为盐处理大豆幼苗时GmNEKl基因的表达
[0045] 图2为GmNEKl过表达载体示意图
[0046] 图3为GmNEKl过表达转基因株系分子鉴定
[0047] 图4为GmNEKl过表达拟南芥在正常条件下的表型
[0048] 图5为GmNEKl过表达植株的生物量和籽粒产量比较
[0049] 图6为GmNEKl过表达株系和对照在不同盐浓度下的表型
[0050] 图7为GmNEKl过表达株系和对照在土壤含水量为30%时的表型
[0051] 图8为GmNEKl过表达株系和对照低温处理24h的表型
【具体实施方式】
[0052] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0053] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0054]农杆菌 GV3101 菌株记载在 Clough-SJ, Bent-AF. Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transforma