用于增强酶活性的方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的夺叉参考
[0002] 本申请要求2012年12月7日提交的美国临时专利申请第61/734, 918号以及2013 年3月15日提交的美国临时专利申请第61/801，982号的权利，其公开内容在此全部并入 以供参考。
技术领域
[0003] 本公开内容大体上涉及增强酶的活性，并且更具体地涉及在例如由生物质中的纤 维素制备糖的过程中使用某些聚合物来增强酶的活性和稳定性。
【背景技术】
[0004] 酶被用在多种商业应用中，包括食品和农业工业、制药工业、以及化学和生物燃料 工业。例如，可以使用纤维素酶例如内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和e-葡糖苷酶来将生物 质的纤维素组分转化成用于制造生物燃料的可发酵糖。总体上，这些纤维素酶已从各种各 样的有机体中分离，并表现出最适宜的温度、pH和底物范围。然而，纤维素酶的成本，常常 成为使用该酶的工艺的商业化过程中的障碍。
[0005] 与酶水解有关的成本能够通过在相同酶负载下增加水解产率或增加反 应器生产能力来降低。已研宄分子生物学方法来改善酶功能并减少底物顽拗性 (recalcitrance)〇 参见WilsonDB.，Curr.Opin.Biotech.，2009,20:295-299。涉 及在水解混合物中包括大分子"添加剂"如表面活性剂的另外可选的方法也已被用 于增加酶产率。参见ErikssonT等人，EnzymeMicrob.Tech.，2002, 31:353-364 ; KaarWE&HoltzappleMT.,Biotechnol.Bioeng., 1998,59(4) :419-427; KristensenJB等人，EnzymeMicrob.Tech. ,2007, 40:888-895;KumarR&Wyman CE.，Biotechnol.Bioeng.,2008， 102(6):1544-1557;QingQ等人，Bioresource Technol.，2010, 101:5941-5951;SiposB等人，C.R.Biol.，2011，334:812-823 ;以及Zheng Y等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，2008, 146:231-248。然而，这些添加剂在何种水平增 强酶活性可能基于多种因素变化，包括酶负载、底物预处理、水解温度、以及底物和酶的选 择。因此，本领域需要的是更一致且可靠、在工业规模上可行的能够改善酶的活性和稳定性 的方法。
[0006] 与酶水解有关的成本还能够通过经多轮处理以收集和再利用酶而被降低。例 如，已经完成了在固定纤维素酶领域的工作，包括其共价连接或吸附在例如二氧化硅 晶片、硅石、玻璃珠、藻酸钙珠和磁性纳米颗粒的底物上。参见例如，Ogeda等人，J. Biotechnol. 2012, 157, 246-252;Lupoi等人，Biotechnol.Bioeng. 2011，108, 2835-2843 ; Mandali&Dalaly,ASTMIntern. 2010, 7, 1-10；Andriani等人,Bioprocess.Biosyst. Eng. 2012, 35, 29-33 ;Jordan等人，gala,C.J.Mol.Catal.B-Enzym. 2011, 68, 139-146;Xu 等人，Biocatal.Biotransfor. 2011, 29, 71-76。还已经完成了在涉及可逆可溶-不可溶聚 合物-纤维素酶材料的领域内的工作，最通常使用pH敏感聚合物如EudragitL-100或甲 基丙稀酸聚合物。参见例如，Taniguchi等人，Biotechnol.Bioeng. 1989, 34, 1092-1097 ;Liang&Cao,X.BioresourceTechnol.2012，116，140-146;Zhang等人,Biocatal. Biotransfor. 2010, 28, 313-319。然而，这些材料将工业操作限制在相当窄的pH范围内且 需要多重PH调节以回收和再利用该酶。因此，本领域还需要的是在工业规模上可行的能够 通过经多轮处理以再循环酶来降低酶成本的替代方法。
【发明内容】
[0007] 本文提供了在一种或多种底物分解（例如，水解）的过程中增加酶活性或减少酶 或酶的混合物变性的方法，通过使底物与酶或酶的混合物以及至少一种本文所述聚合物接 触。能够在本文所述聚合物存在下分解至少一部分底物的任何合适的酶或酶的混合物可以 被用于所提供的方法中。合适的酶可以包括，例如，纤维素酶、半纤维素酶、木质酶、脂酶、淀 粉酶、磷酸酶和木聚糖酶。例如，酶可以是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、e-葡糖苷酶、或 多糖单加氧酶、或者任何这些酶的混合物，且底物可以是，例如，生物质、纤维素、二糖和其 他多糖。这样的酶在本文所述聚合物的存在下可以使底物水解以产生糖。
[0008] 本文还提供了通过使底物与酶和至少一种本文所述聚合物接触以对底物进行预 处理的方法，包括至少一种本文所述聚合物，以产生预处理的底物，其中与未经该预处理的 底物的水解相比，预处理底物随后的水解引起更高的产率。
[0009] 用于本文所述任何方法的聚合物可以包括多个具有式（I)结构的单体残基：
[0010]
【主权项】
1. 一种方法，包括使至少一种底物与至少一种酶和至少一种聚合物接触，所述聚合物 包括多个具有式（I)结构的单体残基： 其中：
R1在每次出现时独立地为H或烷基；并且 Ra和Rb在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族 基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基； 条件是Ra和R B中的至少一个不是H。
2. 根据权利要求1所述的方法，还包括酶促分解至少一部分的所述底物以产生至少一 种产物。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，还包括通过将至少一种所述聚合物从所述至少一 种产物中分离而回收至少一种所述聚合物。
4. 根据权利要求3所述的方法，还包括： i) 提供另外的底物、另外的酶或酶的混合物、以及至少一种所回收的聚合物； ii) 使所述另外的底物与所述另外的酶或酶的混合物在至少一种所回收的聚合物的存 在下接触；以及 iii) 酶促分解至少一部分的另外的生物质。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中具有式（I)结构的单体残基是式 (I-Al)的单体残基：
其中： Rai在每次出现时是未取代或取代的-脂肪族基团-、未取代或取代的-脂环族基团-、 未取代或取代的-芳基_、未取代或取代的-杂芳基_、或者未取代或取代的-杂环基-;并 且 Ra2和Ra3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环 族基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基。
6. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中具有式（I)结构的单体残基是式 (I-A2)的单体残基：
7. 根据权利要求6所述的方法，其中式（I-A2)的单体残基是：
8. 根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中至少一种所述聚合物是均聚物或共聚 物。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述共聚物包括： 多个式（I-A2)的第一单体残基： 其中：
R1为H或烷基； Ra为未取代的烷基；且 Rb为H ;以及 多个式（I-A2)的第二单体残基， 其中： R1为H或烷基； Ra为未取代的烷基、或被1-5个-OH基取代的烷基； Rb 为 H， 条件是所述第一单体残基的R1、Ra和R B中的至少一个不同于所述第二单体残基的R \ Ra^P Rb〇
10. 根据权利要求9所述的方法，其中：
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述共聚物还包括多个独立地具有式（II-Bl)或 (II-B2)结构的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基：
其中： R1在每次出现时独立地为H或烷基； r在每次出现时独立地为大于或等于1的整数； X在每次出现时独立地为未取代或取代的-脂肪族基团-、未取代或取代的-脂环族基 团_、未取代或取代的-芳基_、未取代或取代的-杂芳基_、未取代或取代的-杂环基_、未 取代或取代的-醚_、或-(CH 2) jNHCO-，其中j为整数，且j在每次出现时独立地至少为1 ; 并且 R2和R3在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族 基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、未取代或取代的杂环基、或-C(O)Ra, 其中RaS H、烷基或羟基；或者R 2和R 3连同与其连接的碳一起形成5-或6-元未取代或取 代的杂环基。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中式（II-Bl)的具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体 残基具有式（II-Bla)或（II-B2a)的结构：
13. 根据权利要求11-12中任一项所述的方法，其中X在每次出现时是-乙二 醇-或 _ (CH2) jNHCO-。
14. 根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中至少一种所述聚合物是热响应性 的。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中至少一种所述聚合物具有至少10°C的LCST。
16. 根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述至少一种酶选自纤维素酶、半 纤维素酶、木质酶、脂酶、淀粉酶、磷酸酶和木聚糖酶。
17. -种水解生物质的方法，包括： a) 提供生物质、水解酶和热响应聚合物； b) 使所述生物质与所述水解酶在所述热响应聚合物的存在下接触， 其中所述热响应聚合物为： 聚N-异丙基丙烯酰胺， 聚N-异丙基甲基丙烯酰胺，或者 包括多个第一单体残基和多个第二单体残基的共聚物，其中各个所述第一单体残基独 立地选自N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺及其任意组合，且各个所述第二单体 残基是具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基；以及 c) 水解至少一部分的所述生物质以产生糖。
18. -种组合物，包括： 至少一种底物； 至少一种酶；以及 至少一种聚合物，所述聚合物包括多个具有式（I)结构的单体残基：
其中： R1在每次出现时独立地为H或烷基；并且 Ra和Rb在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族 基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基； 条件是Ra和R B中的至少一个不是H。
19. 一种组合物，包括： 至少一种残余底物； 至少一种产物； 至少一种酶；以及 至少一种聚合物，所述聚合物包括多个具有式（I)结构的单体残基：
其中： R1在每次出现时独立地为H或烷基；并且 Ra和Rb在每次出现时独立地为H、未取代或取代的脂肪族基团、未取代或取代的脂环族 基团、未取代或取代的芳基、未取代或取代的杂芳基、或者未取代或取代的杂环基； 条件是Ra和R B中的至少一个不是H。
20. 根据权利要求18或19所述的组合物，其中所述至少一种酶选自纤维素酶、半纤维 素酶、木质酶、脂酶、淀粉酶、磷酸酶和木聚糖酶。
【专利摘要】本文提供的是用某些可以任选地与酶连接的聚合物来增强酶活性的方法。聚合物可以是热响应聚合物，包括聚N-异丙基丙烯酰胺或聚N-异丙基甲基丙烯酰胺。聚合物还可以是具有至少两种不同单体残基的共聚物。单体残基可以具有式(I)的结构：其中R1、RA和RB如说明书所述。这样的单体残基的实例可以包括N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)和N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMa)。聚合物可以包括另外的单体残基，如具有氨氧基的甲基丙烯酰胺单体残基，其可以被改性以改变聚合物的低临界溶解温度(LCST)。
【IPC分类】C08F20-56, C12N11-08, C12P19-14
【公开号】CN104838011
【申请号】CN201380064084
【发明人】M·B·弗朗西斯, K·J·麦肯齐
【申请人】加利福尼亚大学董事会
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2013年12月6日
【公告号】WO2014089510A1