海参组织蛋白酶的胶原酶解活性检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酶解活性检测方法，尤其涉及海参组织蛋白酶的胶原酶解活性检测方法。
【背景技术】
[0002]胶原蛋白是机体组织的结构蛋白，其诸多生理功能已被系统研宄和广泛认可。目前国内胶原蛋白产业发展迅速，随着胶原蛋白产业的快速发展，胶原蛋白酶解工艺中的关键生产要素一蛋白酶的需求也不断增长。目前较为常用的胶原蛋白酶从来源上可分为植物蛋白酶(如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等)、动物蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶等)、微生物蛋白酶等。目前上述各类酶普遍存在胶原蛋白酶解效率不高的缺点，因此，研发新型高效胶原蛋白酶具有重要的应用价值。而作为该研发工作中的一环，胶原蛋白酶的胶原酶解活性功能评价分析技术非常重要，目前迫切需要有一套简单可行且面向应用的方法技术。本发明专门用于人工表达的海参组织蛋白酶胶原蛋白酶解活性评价，具有简单便利、准确可靠的特征，具有很高的应用价值。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于针对现有技术提供一种适用于海参蛋白酶、能半定量化评价海参组织蛋白酶的胶原酶解活性、原料获取便利的海参组织蛋白酶的胶原酶解活性检测方法。
[0004]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:海参组织蛋白酶的胶原酶解活性检测方法，包括，其中:采用海参组织蛋白酶对胶原蛋白凝胶表面酶解产生的凹陷直径进行酶解效果评价。对酶活性采用酶解直径或面积进行评价，能得到半定量的结果。可以满足大部分的酶活性评价需求，且较为准确。
[0005]为优化上述技术方案，采取的措施还包括:检测方法具有如下步骤:
1)胶原蛋白凝胶制作:利用日常生活中常见的富含胶原蛋白食品原料作为制作材料，经过熬制、去脂肪、过滤去杂、PH值调整、固形物测定、倒板凝结步骤处理，制成胶原蛋白凝胶；
2)蛋白酶溶液配制:将蛋白酶标准品以1mg/mL、lmg/mL、0.lmg/mL、0.0lmg/mL及
0.001mg/mL的浓度进行溶解制备酶液，测试用的海参组织蛋白酶采用蛋白酶标准品配置的浓度之一进行配制；
3)酶解曲线制作:取少量配制完成的标准蛋白酶及海参组织蛋白酶溶液，滴于胶原蛋白凝胶表面；加盖密闭后恒温酶解；迅速将酶解后的平板放入低温环境，待冷却后，快速测量酶解形成圆形凹陷的表面直径，统计分析直径数据，制作酶解曲线；
4)海参组织蛋白酶活性分析:以海参组织蛋白酶酶解形成的凹陷直径数据比对标准蛋白酶酶解数据制作的酶解曲线，查找海参组织蛋白酶对应的标准蛋白酶浓度特征，换算查得海参组织蛋白酶活性相对值。步骤I)中，富含胶原蛋白食品原料选自鱼皮或鸡爪或猪皮；所述熬制过程温度为85-125°C，熬制时间为5-30min，可通过离心及冷冻去除脂肪。步骤I)中，可利用HCl和NaOH等酸碱进行溶液pH值调整，根据不同胶原蛋白原料特性，调整固形物浓度为10-50%，利用常用的盘碟、培养皿等作为倒板器皿。步骤2)中，所使用的蛋白酶一般选择胶原蛋白酶解活性较强的复合酶作为标准品，所配制的酶液需调整PH至酶活性最佳条件，海参组织蛋白酶样品配置的PH—般为3.5-8.5，配制终浓度为lmg/mL。步骤3)中，蛋白酶溶液一般取5-500微升，使用培养皿盖、保鲜膜等封闭蛋白酶液及胶原凝胶，小心转移至水浴锅、恒温培养箱等设备中，保持20-60°C条件酶解10-60min。所述步骤中，酶解结束后应将平板迅速放入零下低温环境，以抑制酶解；之后测量酶解形成圆形凹陷的表面直径，统计分析直径数据，制作酶解曲线。
[0006]由于本发明采用了采用海参组织蛋白酶对胶原蛋白凝胶表面酶解产生的凹陷直径进行酶解效果评价。对酶活性采用酶解直径或面积进行评价，能得到半定量的结果。可以满足大部分的酶活性评价需求，且较为准确。因而本发明具有适用于海参蛋白酶、能半定量化评价海参组织蛋白酶的胶原酶解活性、原料获取便利的优点。
【附图说明】
[0007]图1为本发明实施例滴加酶液时的状态示意图；
图2为本发明实施例酶解13min后形成的圆形酶解凹陷。
【具体实施方式】
[0008]以下结合附实施例对本发明作进一步详细描述。
[0009]实施例:参照图1至图2，海参组织蛋白酶的胶原酶解活性检测方法，包括，其中:采用海参组织蛋白酶对胶原蛋白凝胶表面酶解产生的凹陷直径进行酶解效果评价。对酶活性采用酶解直径或面积进行评价，能得到半定量的结果。可以满足大部分的酶活性评价需求，且较为准确。检测方法具有如下步骤:
1)胶原蛋白凝胶制作:利用日常生活中常见的富含胶原蛋白食品原料作为制作材料，经过熬制、去脂肪、过滤去杂、PH值调整、固形物测定、倒板凝结步骤处理，制成胶原蛋白凝胶；
2)蛋白酶溶液配制:将蛋白酶标准品以1mg/mL、lmg/mL、0.lmg/mL、0.0 lmg/mL及
0.001mg/mL的浓度进行溶解制备酶液，测试用的海参组织蛋白酶采用蛋白酶标准品配置的浓度之一进行配制；
3)酶解曲线制作:取少量配制完成的标准蛋白酶及海参组织蛋白酶溶液，滴于胶原蛋白凝胶表面；加盖密闭后恒温酶解；迅速将酶解后的平板放入低温环境，待冷却后，快速测量酶解形成圆形凹陷的表面直径，统计分析直径数据，制作酶解曲线；
4)海参组织蛋白酶活性分析:以海参组织蛋白酶酶解形成的凹陷直径数据比对标准蛋白酶酶解数据制作的酶解曲线，查找海参组织蛋白酶对应的标准蛋白酶浓度特征，换算查得海参组织蛋白酶活性相对值。步骤I)中，富含胶原蛋白食品原料选自鱼皮或鸡爪或猪皮；所述熬制过程温度为85-125?，熬制时间为5-30min，可通过离心及冷冻去除脂肪。步骤I)中，可利用HCl和NaOH等酸碱进行溶液pH值调整，根据不同胶原蛋白原料特性，调整固形物浓度为10-50%，利用常用的盘碟、培养皿等作为倒板器皿。步骤2)中，所使用的蛋白酶一般选择胶原蛋白酶解活性较强的复合酶作为标准品，所配制的酶液需调整pH至酶活性