利用四带模拟移动床系统制备高纯度牡蛎蛋白肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高纯度牡蛎蛋白肽的制备技术，具体地说是一种利用四带模拟移动床系统制备高纯度牡蛎蛋白肽的方法。
【背景技术】
[0002]生物活性肽(b1activ peptides)是一类由蛋白质中20种天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线形、环形结构的不同肽类的总称，其分子量介于蛋白质和氨基酸之间，具有多种生物活性，能够直接参与摄食、消化、代谢及内分泌的调解，其吸收机制优于蛋白质和氨基酸。生物活性肽以非活性状态存在于蛋白质的长链中，当用适当的蛋白酶水解时，可将其释放出来。目前，大量的研宄结果表明，生物活性肽具有如抗病毒、抗癌、抗血栓、抗高血压、免疫调节、激素作用、抑菌、降胆固醇等生理作用，因此，提取和制备具有高纯度的生物活性肽类物质便成为当今全世界研宄的热点。
[0003]牡蛎是一种珍贵海洋贝类，具有很高的营养价值，牡蛎中含有丰富的蛋白质、必需氨基酸、糖原、牛磺酸、维生素、矿物质以及锌砸等具有特殊生理作用的微量元素，是天然的活性物质宝库，有“海洋牛奶”之称。其中，牡蛎源蛋白质的含量高，活性优良，是一种提取生物活性肽的理想原材料，先已有研宄表明牡蛎原活性肽具有促进免疫、调节激素、降血压、降血脂等功能。同时，我国是水产养殖的大国，有着极其丰富的牡蛎资源，可以为制备活性狀的生广提供尚品质的原料。
[0004]然而，目前中国的牡蛎资源生加工行业较为落后，通常仅将其作为食品进行简单加工，产业附加值较低；仅有的一些活性肽产品制备企业则通常只能利用酶解技术制备活性肽混合物，无法将其进一步纯化获得高纯度纯品，以提高其附加值。
[0005]如何发明了一种制备高纯度纯品牡蛎蛋白肽的方法，可以提纯特定分子量的活性肽片段，产品可作为标准品或药物作用前体应用，大幅度的提高产品的附加值，可带动牡蛎养殖产业链的进步升级。这是目前亟待解决的技术课题。
【发明内容】
[0006]本发明为解决现有技术存在的问题，提供一种利用四带模拟移动床系统制备高纯度牡蛎蛋白肽的方法，可以提纯特定分子量的活性肽片段，产品可作为标准品或药物作用前体应用，提高产品的附加值。
[0007]本发明的目的是通过如下技术方案实现的:一种利用四带模拟移动床系统制备高纯度牡蛎蛋白肽的方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)将牡蛎软体经过粉碎、脱脂处理后，加入蛋白酶进行酶降解处理，酶解液经过离心沉淀后过滤，得到原料液A ;
(2)所述原料液A经过分子量截留装置处理，获得特定分子量段的肽液，同时，去除原料液A中的多糖及杂质，实现纯化效果，得到多肽混合液B ;
(3)所述多肽混合液B经过离子交换层析系统进行进一步纯化后，收集浓缩至5-30g/L，得到进样液C ;
(4)所述进样液C利用四带模拟移动床系统制备高纯度牡蛎蛋白肽，以按比例混合的乙腈和水为洗脱液，控制四带模拟移动床系统各区间切换时间及系统流速，从萃余液出口得到目标分子量的萃余液D ;萃取液E为非目标蛋白，作为原料进行其他分子量蛋白肽提取；
(5)所述高纯度牡蛎蛋白肽溶液D进过减压浓缩，冻干后，得到高纯度牡蛎蛋白肽粉末，目标蛋白占总蛋白的重量比大于90%。
[0008]对上述技术方案的改进:所述分子量截留装置通过截留过大分子量以及放流较小分子量多肽片段，获得特定分子量段的酶解原液，其分子量选择范围分布在0.1-10 kDa。
[0009]对上述技术方案进一步的改进:所述的离子交换层析系统为阴离子交换层析，其洗脱液为NaCl溶液。
[0010]对上述技术方案进一步的改进:所述步骤(4)中洗脱液中乙腈:水的体积比例为30: 70-50:50。
[0011]对上述技术方案进一步的改进:所述四带模拟移动床系统包括洗脱泵、进样泵、萃取泵、反相层析柱、电磁阀、单向阀和控制器及计算机，进样液C的浓度为5-30 g/L，洗脱泵流量I?200为mL/min，压力为I?40MPa ;进样泵流量为I?500mL/min，压力为I?40MPa，萃取泵流量为O?200mL/min，压力为O?40MPa，工作温度为15_45°C。
[0012]对上述技术方案进一步的改进:所述四带模拟移动床系统中色谱系统由8?16根反相层析柱组成，分成洗杂区、富集区、洗脱区和再生区共4个区，每区有2?4反相层析柱，其中，所述洗杂区位于洗脱液入口与萃取液出口之间，在洗杂区实现非目标蛋白的解析；所述富集区位于萃取液出口与进样口之间，在富集区使非目标蛋白肽反复吸附、解吸、浓缩；所述洗脱区位于进样口与萃余液出口之间在洗脱区得到目标活性肽；所述再生区位于萃余液D出口与洗脱液入口之间，一方面洗脱区的洗脱液进入到再生区可再生后循环利用，另一方面将所述洗脱区与洗杂区隔开，防止萃余液D中的目标蛋白肽进入到所述洗杂区。
[0013]本发明与现有技术相比有许多优点和积极效果:
1.本发明首次利用四带模拟移动床对酶解牡蛎蛋白肽混合物进行了纯化，得到了高纯度的单一分子量活性肽，提高了产品附加值，同时提高了产品活性；
2.本发明利用四带模拟移动床提高了分离效率及产品纯度，回收率可达85%(w/w)以上，产品纯度大于90% (S卩目标蛋白占总蛋白的重量比，w/w),同时，本发明实现了流动相的循环再生利用，降低了有机试剂的用量，节约了成本；
3.本发明利用分子量截留装置及离子交换色谱对样品进行了前纯化处理，初步提高了进样料液的纯度，提高了模拟移动床系统的效率；
4.本发明利用酶解技术处理牡蛎软体，相较于化学法降解蛋白，活性肽结构不被破坏，保证了活性，提高了产物品质。
【具体实施方式】
[0014]下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述:
本发明一种利用四带模拟移动床系统制备高纯度牡蛎蛋白肽的方法的实施方式，具有以下步骤:
(1)将牡蛎软体经过粉碎、脱脂处理后，加入蛋白酶进行酶降解处理，酶解液经过离心沉淀后过滤，得到原料液A ;
(2)所述原料液A经过分子量截留装置处理，获得特定分子量段的肽液，同时，去除原料液A中的多糖及杂质，实现纯化效果，得到多肽混合液B ;
(3)所述多肽混合液B经过离子交换层析系统进行进一步纯化后，收集浓缩至5-30g/L，得到进样液C ;
(4)所述进样液C利用四带模拟移动床系统制备高纯度牡蛎蛋白肽，以按比例混合的乙腈和水为洗脱液，控制四带模拟移动床系统各区间切换时间及系统流速，从萃余液出口得到目标分子量的萃余液D ;萃取液E为非目标蛋白，作为原料进行其他分子量蛋白肽提取；
(5)所述高纯度牡蛎蛋白肽溶液D进过减压浓缩，冻干后，得到高纯度牡蛎蛋白肽粉末，目标蛋白占总蛋白的重量比大于90%。
[0015]以下为本发明的具体实施例:
实施例1:
一种利用四带模拟移动床系统制备高纯度牡蛎蛋白肽的方法，步骤如下:
模拟移动床系统制备高纯度牡蛎蛋白肽的方法，步骤如下:
1.活性肽液制备
牡蛎软体经过粉碎、脱脂等步骤处理后为原料，利用2% (占原料重量百分比)木瓜蛋白酶进行降解，得到牡蛎酶解混合物，经过离心沉淀及过滤得到原料液A ;利用分子量截留技术，去除原料液A中的多糖及杂质，获得分子量在7-8 kDa的多肽混合液B ;利用DEAE-Sepharose FF填充的阴离子交换树脂对多肽混合液进行进一步纯化，并将纯化组分浓缩至10 g/L，得到进样活性肽液C。
[0016]2.高纯度活性肽的纯化
应用四带模拟移动床色谱系统对其进行最终纯化，系统由洗脱泵、进样泵、萃取泵、反相层析柱、电磁阀、单向阀和控制器及计算机等组成，包括8个反相层析柱，分成洗杂区、富集区、洗脱区和再生区共4个区，每区2根反相层析柱，反相层析柱优选C-8填料反相层析柱，洗脱泵流量200 mL/min，压力40 MPa ;进样泵流量500 mL/min，压力40 MPa，萃取泵流量200 mL/min，压力40 MPa，工作温度45 °C;流动相由乙腈:水=35:65 (v/v，含有0.1TFA)。
[0017]系统通过定期控制电磁阀的切换，切换时间为15min，收集萃余液D，溶液进过减压浓缩，冷冻干燥，得到高纯度牡蛎蛋白肽粉末，回收率达85% (w/w)以上，目标蛋白占总蛋白的重量比大于90%，萃取液E为非目标蛋白，作为原料进行其他分子量蛋白肽提取。
[0018]实施例2:
一种利用四带模拟移动床系统制备高纯度牡蛎蛋白肽的方法，步骤如下:
1.活性肽液制备
牡蛎软体经过粉碎、脱脂等步骤处理后为原料，利用2% (占原料重量百分比)胰蛋白酶配合木瓜蛋白酶进行降解，得到牡蛎酶解混合物，经过离心沉淀及过滤得到原料液A ;利用分子量截留技术，去除原料液A中的多糖及杂质，获得分子量在4-5kDa的多肽混合液B ;利用DEAE-Sepharose FF填充的阴离子交换树脂对多肽混合液进行进一步纯化，并将纯化组分浓缩至20 g/L，得到进样活性肽液C。
[0019]2.高纯度活性肽的纯化
应用四带模拟移动床色谱系统对其进行最终纯化，系统由洗脱泵、进样泵、萃取泵、反相层析柱、电磁阀、单向阀和控制器及