一种阿胶及其衍生产品高纯度dna的提取试剂盒及其提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品检测技术领域，具体设及一种阿胶及其衍生产品高纯度DNA的提 取试剂盒及其提取方法。
【背景技术】
[0002] 现代药典将阿胶定义为：W马科动物驴的皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。其味甘、 平，入肺、肝、肾经，具有补血止血、滋阴润燥等功效，药食两用。目前阿胶市场价格大幅上 涨，各地均出现了用其他动物皮熬制的代用品，采用骨胶、杂皮等熬制的胶类假药不仅临床 效果差，而且还可能出现中毒现象。就驴皮胶或马皮胶或牛皮胶等外观来看十分相似，难W 辨别。加之造假者多W在驴皮中渗入部分杂皮胶，使得阿胶的鉴别更是难上加难。目前较 前沿的鉴别方法为分子鉴定法，即将阿胶的DNA提取出来，利用分子生物学手段（如PCR技 术）检测所提取DNA的动物来源，W确定阿胶的真伪。但由于阿胶本身属于蛋白质成分高 且黏性大的物质，致使DNA提取较难，而且其在制作过程中，原料经反复熬煮，致使DNA部分 遭到破坏，更增加了DNA提取的难度。近几年，阿胶衍生产品如阿胶糕、阿胶液等大量涌现， 其阿胶成分的含量进一步降低，致使其DNA提取的难度进一步加大。
[000引从成分复杂的阿胶及其衍生产品中提取的DNA，其中多含有能干扰PCR的抑制物， 容易导致DNA检测失败（假阴性）。大部分PCR抑制因子（蛋白质、多糖、酪类、脈、腐酸和 血红素等）都与DNA有相似的溶解性，使用经典DNA提取方法（CTAB/SDS，蛋白酶和酪-氯 仿-异戊醇处理）不容易完全除去，运些物质成了DNA最终提取液的污染物。此外，经典 DNA提取方法中使用的酪、氯仿等有机试剂具有较大的毒性和腐蚀性，存在危害检验人员身 屯、健康的风险。除经典DNA提取方法外，发明专利（【申请号】CN201410317118. 7)还公开了 一种从阿胶中快速提取DNA的试剂盒及其提取方法，但该试剂盒中所用试剂种类较多，价 格昂贵，且个别试剂稀缺不容易购买，从而增加了检测和时间成本。
[0004] 因此，提供一种适用于从成分复杂的阿胶及其衍生产品中提取DNA的试剂盒是目 前亟待解决的问题，对于阿胶及其衍生产品的分子学鉴定具有十分重要的意义。
【发明内容】
阳0化]针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种阿胶及其衍生产品高纯度DNA的提 取试剂盒及其提取方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种阿胶及其衍生产品高纯度DNA的提取试剂盒，由组分I、组分II、蛋白酶K溶 液和RNA酶溶液组成；
[0008] 所述组分I的组成为：0. 08-0. 12M十二烷基硫酸钢（SDS)，0. 8-1. 2MTris-HCl, 0. 4-0.SMNazEDTA,PH= 7. 5-8. 5 ;
[0009] 所述组分II的组成为：8. 0-8. 5MCsCl，8-12mMTris-肥 1，PH= 7. 5-8. 5。
[0010] 所述蛋白酶K溶液的浓度为15-25mg血I;优选的，所述蛋白酶K溶液的浓度为 2OmgmL1。 阳0川所述RNA酶溶液的浓度为80-120mg血1;优选的，所述RNA酶溶液的浓度为IOOmgmL1。RNA酶溶液的主要作用是降解残存的RNA，进一步的提高DNA的纯度；因此RNA 酶溶液的浓度需要适度，不宜过高或过低，过高会增加DNA提纯的难度，过低则会使RNA降 解不彻底。 阳〇1引 优选的，所述组分I的组成为：0.IMSDS，1.OMTris-肥1,0. 5M胞2邸TA,PH= 8. 0。 阳〇1引 优选的，所述组分II的组成为：8. 3MCsCl,IOmMTris-HCl,PH= 8. 0。
[0014] 本发明还提供了采用该提取试剂盒从阿胶及其衍生产品中提取高纯度DNA的方 法，步骤为：向待检的阿胶或其衍生产品中加入提取试剂盒中的组分I、蛋白酶K溶液和RNA 酶溶液，经沉淀、分离得到DNA粗提物，阿胶或其衍生产品与组分I、蛋白酶K溶液、RNA酶溶 液加入量的比为（0. 5-1. 2)g: (0. 8-1. 2)血：（4-6)yL: (4-6)yL;
[0015] 向DNA粗提物中加入组分II溶解，250000-260000g离屯、28-3化，使组分II形成 连续的密度梯度，将溶解在组分II中DNA粗提物的DNA与杂质分离，即得到进一步提纯的 DNA。
[0016] 上述提取高纯度DNA的方法，具体步骤如下：
[0017] (1)向待检的阿胶或其衍生产品中加入组分I、蛋白酶K溶液和RNA酶溶液，混匀， 60-70°C水浴1-化，离屯、，取上清，得溶液A;阿胶或其衍生产品与组分I、蛋白酶K溶液、RNA 酶溶液加入量的比为（0. 5-1. 2)g: (0. 8-1. 2)mL: (4-6)yL: (4-6)yL; 阳0化]似向溶液A中加入化08-0. 12)倍体积的乙酸钟溶液和（1. 5-2.W倍体积的乙 醇溶液，在液氮中放置4-6min，或（-80°C至-20°C)放置0. 5-比，离屯、，弃上清，得沉淀B;
[0019] 做向沉淀B中加入组分II溶解，用紫外分光光度计测定溶解后的溶液中DNA的 含量，按DNA:双苯酷亚胺质量比=2:1加入双苯酷亚胺染色，混匀，避光过夜，调节溶液折 射率为1. 3-1. 4,离心UV365nm下吸取DNA条带，得溶液C;
[0020] (4)向溶液C中加入等体积异丙醇，混匀，分层后弃去上层溶液，重复此过程直至 在UV365nm下观察不到巧光，再加入2-3倍体积80%乙醇，离屯、，弃去上清，洗涂沉淀，惊干 后加入(1地2〇溶解得到阿胶DNA溶液。
[0021] 步骤（2)中，所述乙酸钟溶液的浓度为3mol/L，PH= 5. 2。 阳02引步骤（3)中，所述双苯酷亚胺的浓度为0. 5mg血1。
[0023] 优选的，步骤（1)中，阿胶或其衍生产品与组分I、蛋白酶K溶液、RNA酶溶液加入 量的比为 0). 5-1. :1 血：5yL:5yL。
[0024] 优选的，步骤（I)中，水浴溫度为65°C，水浴时间为I.化；离屯、条件为：12000g离 屯、ISmin。 W巧]优选的，步骤似中，放置的条件为：在液氮中放置5min，或-80°C放置0.化， 或-20°C放置比。上述放置操作的目的是使DNA粗提物析出，有利于下一步离屯、分离。
[0026] 优选的，步骤似中，离屯、的条件为：12000g离屯、IOmin;离屯、的目的是沉淀、分离 DNA粗提物。
[0027] 优选的，步骤（3)中，离屯、的条件为：254800g离屯、30h。该步骤中通过超高速长时 间离屯、可使得组分II形成连续的密度梯度，溶解在其中的DNA粗提物中的DNA与蛋白质、 盐类小分子等杂质，因分子量大小不同会聚集在组分II中不同位置，有利于下一步高纯度 分离DNA。
[0028] 本发明的有益效果：
[0029] (1)本发明的提取试剂盒特别适用于从成分复杂的阿胶及其衍生品中提取阿胶 的基因组DNA，针对阿胶及其衍生品中的蛋白成分高且黏度大、DNA含量少且高度降解的特 点，本发明的提取试剂盒首先用SDS将细胞膜裂解，在蛋白酶K、邸TA的存在下消化消化蛋 白质或多肤或小肤分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来；在RNA酶存在下降 解残存的RNA，进一步提高DNA纯度；在超高速长时间离屯、时，组分II从液面到底部出现一 定的连续密度梯度，针对溶解在组分II中的DNA粗提取物的各种成分，比溶剂密度大的物 质会产生大分子沉降，比溶剂密度小的物质则会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置聚集 形成大分子带状物，因此，利用DNA与蛋白质、盐类小分子等杂质的分子量大小不同，DNA单 独聚集在特定位置形成一条带状物，有利于DNA的高纯度分离与纯化。
[0030] (2)本发明的DNA提取试剂盒中的试剂来源广泛，成本较低，降低了检测的成本。 [00川做本发明的DNA提取方法未使用毒性和腐蚀性较大的酪、氯仿等有机试剂，提取 过程安全性好。
【附图说明】 阳03引图1为实施例1中DNA在提取试剂盒的组分II中的分布，图中，A、B、C分别为阿 胶、阿胶糕和阿胶液；
[0033] 图2为实施例2中用本发明提取试剂盒所得阿胶及其衍生产品DNA中驴源性成 分的实时巧光PCR扩增曲线；每次PCR设2次平行反应；图中，1 :阳性对照，Ct平均值为 18. 98 ;2、3、4分别为实施例1中阿胶、阿胶糕和阿胶液的DNA扩增曲线，Ct平均值依次为 26. 01、26. 54、27. 18 ;5 :空白对照，无明显扩增。
【具体实施方式】
[0034] 结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本 发明，并不对其内容进行限定。
[00对实施例1 :采用本发明的提取试剂盒提取阿胶及其衍生产品中的DNA
[0036] 1.提取试剂盒：
[0037]由组分I、组分II、蛋白酶K溶液和RNA酶溶液组成；
[0038]组分I的组成为：0.IMSDS，1.OMTris-肥1,0.5MNazEDTA,PH= 8.0 ;