一种酶促苄氧羰基-丙氨酰-谷氨酰胺的合成方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种深度共熔溶剂中酶促苄氧羰基-丙氨酰-谷氨酰胺的合成方法，属于生物化工领域。
【背景技术】
[0002]二肽是在两个氨基酸单体中加入一个肽键，在制药和食品行业都很重要，谷氨酰胺是人体血液中最重要的氨基酸之一，并且在预防肠道萎缩方面扮演重要角色。然而，由于谷氨酰胺的热不稳定性和低溶解度，很难被直接利用。因此，丙氨酰-谷氨酰胺二肽由于它的稳定性和高溶解度，在医学领域被广泛的用来替代谷氨酰胺作为病人输液的组成部分。目前为止，三个主要技术可用于多肽合成:化学合成、细胞发酵技术、酶的合成。由于条件温和、最低的侧链保护和酶的定向性，使用丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶(例如木瓜蛋白酶)作为一种生物催化剂，已成为20世纪非常新颖和有前途的研宄领域。
[0003]N-苄氧羰基-谷氨酰胺-丙氨酸(Z-Ala-Gln)是Ala-Gln的前体，使用酶的Z-Ala-Gln合成方法是使用木瓜蛋白酶作为生物催化剂与Z-Ala-OMe和Gln随着酰基供体和亲核试剂在水中溶解，这个方法分别使用获得的二肽产量大约是35-36%。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种简单的基于静电自组装技术的固定化方法，形成了纤维素基材-酶-丙烯酰胺三层结构的固定化酶。具有固定化木瓜蛋白酶固定化效率高、酶活回收率高，操作简便，条件温和等特点。
[0005]一种深度共熔溶剂中酶促苄氧羰基-丙氨酰-谷氨酰胺的合成方法，其特征在于包括以下步骤:
[0006]一种酶促苄氧羰基-丙氨酰-谷氨酰胺的合成方法，包括如下步骤:
[0007](I)先将DES与水混合配成DES混合液，再将谷氨酰胺分散在DES混合液中，得到悬浊液；
[0008](2)将Z-ALA-OME溶解在乙醇中，配成浓度为0.3?3.0mmo I/ml的溶液；
[0009](3)将步骤⑴所得悬浊液与三乙胺混合，搅拌溶解，再与含可溶性蛋白的木瓜蛋白酶粉和步骤(2)制得的溶液混合，在30-70°C下搅拌反应l_24h。
[0010]所述步骤(I)所述DES混合液中DES与水的质量比为5%?30%。
[0011 ] 所述DES为尿素-氯化胆碱DES或甘油-氯化胆碱DES。
[0012]所述悬池液中谷氨酰胺的浓度为0.08?0.25mmol/mlo
[0013]所述三乙胺与谷氨酰胺的摩尔比为2.22?10.67。
[0014]步骤(3)形成的反应体系中谷氨酰胺与Z-ALA-OME摩尔比为1.5?4.5。
[0015]所述木瓜蛋白酶粉与三乙胺的比例为37.5?60mg/mmol。
[0016]所述木瓜蛋白酶粉中可溶性蛋白的含量为15%。
[0017]本发明使用深度共熔溶剂为反应介质，以木瓜蛋白酶为催化剂。在最适条件下恒温恒pH进行反应。将反应产物用乙酸乙酯萃取，并旋转蒸发，得到苄氧羰基-丙氨酰-谷氨酰胺。该反应是一个亲核反应，反应物由亲核试剂与酰基供体组成。酰基供体与木瓜蛋白酶首先生成中间体，随后亲核试剂进攻该中间体形成Z-Ala-Gln产物，然而，由于反应体系中的水同样能作为亲核试剂进攻该中间体生成副产物Z-A-OH，因此用传统介质所得到的产率很低。本发明通过在介质中引入DES，在维持酶活性构像的同时降低体系中的水分含量，从而减少副反应的发生。底物谷氨酰胺(Gln)与酰基的供体Z-ALA-OME的比(G/Z)影响了二肽合成的产率。在这个亲核的反应中H2O和谷氨酰胺可以与Z-Ala-酶(ZAE)中间体反应。因此，增加了 G/Z的比减少了水含量，可以导致ZAE形成最终产物Z-Ala-Gln，而不是 Z-Ala-OH0
[0018]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0019](I)DES反应介质成本较低。
[0020](2)通过该方法合成Z-Ala-Gln产率较高，条件温和，且易分离纯化，具有良好的工业价值。
【附图说明】
[0021]图1为不同底物浓度比对产率的影响曲线图。
[0022]图2为不同水含量对产率的影响曲线图。
[0023]图3为不同酶浓度的影响曲线图。
[0024]图4为不同温度对产率的影响曲线图。
[0025]图5为三乙胺浓度对产率的影响曲线图。
[0026]图6为苄氧羰基-丙氨酸-谷氨酰胺高效液相色谱图。
[0027]图7为苄氧羰基-丙氨酸-谷氨酰胺质谱图。
【具体实施方式】
[0028]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0029]实施例1
[0030]将0.2055mmol的谷氨酰胺分散在1.8ml尿素-氯化胆碱DES (含水量16.67%)水溶液中，向所得溶液中加入1.0mmol的三乙胺，搅拌溶解，与含9mg可溶性蛋白的60mg木瓜蛋白酶粉混合，按谷氨酰胺与Z-ALA-OME摩尔比为2，将0.10275mmol的Z-ALA-OME溶解在0.1ml乙醇中，在40°C下放入2ml烧瓶中搅拌反应24h，得到Z-Ala-Gln的产率为62.53%。
[0031]实施例2
[0032]将0.2055mmol的谷氨酰胺分散在1.8ml尿素-氯化胆碱DES (含水量16.67%)水溶液中，向所得溶液中加入1.6mmol的三乙胺，搅拌溶解，与含9mg可溶性蛋白的60mg木瓜蛋白酶粉混合，按谷氨酰胺与Z-ALA-OME摩尔比为2，将0.10275mmol的Z-ALA-OME溶解在0.1ml乙醇中，在40°C下放入2ml烧瓶中搅拌反应18h。得到Z-Ala-Gln的产率为62.62%。
[0033]实施例3
[0034]将0.2055mmol的谷氨酰胺分散在1.8ml尿素-氯化胆碱DES (含水量16.67% )水溶液中，向所得溶液中加入1.0mmol的三乙胺，搅拌溶解，与含9mg可溶性蛋白的60mg木瓜蛋白酶粉混合，按谷氨酰胺与Z-ALA-OME摩尔比为2，将0.10275mmol的Z-ALA-OME溶解在0.1ml乙醇中，在50°C下放入2ml烧瓶中搅拌反应24h。得到Z-Ala-Gln的产率为62.53%。
[0035]实施例4
[0036]将0.2055mmol的谷氨酰胺分散在1.8ml尿素-氯化胆碱DES (含水量16.67% )水溶液中，向所得溶液中加入1.0mmol的三乙胺，搅拌溶解，与含9mg可溶性蛋白的60mg木瓜蛋白酶粉混合，按谷氨酰胺与Z-ALA-OME摩尔比为4.2，将0.0489mmol的Z-ALA-OME溶解在0.1ml乙醇中，在40°C下放入2ml烧瓶中搅拌反应12h。得到Z-Ala-Gln的产率为70.66%。
[0037]实施例5
[0038]将0.2055mmol的谷氨酰胺分散在1.8ml尿素-氯化胆碱DES (含水量16.67% )水溶液中，向所得溶液中加入1.0mmol的三乙胺，搅拌溶解，与含9mg可溶性蛋白的60mg木瓜蛋白酶粉混合，按谷氨酰胺与Z-ALA-OME摩尔比为2，将0.10275mmol的Z-ALA-OME溶解在0.1ml乙醇中，在70°C下放入2ml烧瓶中搅拌反应24h。得到Z-Ala-Gln的产率为15.14%。
[0039]实施例6
[0040]将0.2055mmol的谷氨酰胺分散在1.8ml尿素-氯化胆碱DES (含水量27.78% )水溶液中，向所得溶液中加入1.0mmol的三乙胺，搅拌溶解，与含9mg可溶性蛋白的60mg木瓜蛋白酶粉混合，按谷氨酰胺与Z-ALA-OME摩尔比为2，将0.10275mmol的Z-ALA-OME溶解在0.1ml乙醇中，在40°C下放入2ml烧瓶中搅拌反应18h。得到Z-Ala-Gln的产率为48.67%。
【主权项】
1.一种酶促苄氧羰基-丙氨酰-谷氨酰胺的合成方法，其特征在于，包括如下步骤:(1)先将DES与水混合配成DES混合液，再将谷氨酰胺分散在DES混合液中，得到悬浊液； (2)将Z-ALA-OME溶解在乙醇中，配成浓度为0.3?3.0mmo I/ml的溶液； (3)将步骤(I)所得悬浊液与三乙胺混合，搅拌溶解，再与含可溶性蛋白的木瓜蛋白酶粉和步骤(2)制得的溶液混合，在30-70°C下搅拌反应l_24h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)所述DES与水的质量比为5%?30%。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述DES为尿素-氯化胆碱DES或甘油_氯化胆喊DES。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述悬浊液中谷氨酰胺的浓度为0.08 ?0.2Smmol /ml 0
5.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述三乙胺与谷氨酰胺的摩尔比为 2.22 ?10.67。
6.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)形成的反应体系中谷氨酰胺与Z-ALA-OME摩尔比为1.5?4.5。
7.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶粉与三乙胺的比例为 37.5 ?60mg/mmol。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶粉中可溶性蛋白的含量为 15%。
【专利摘要】本发明公开了一种酶促苄氧羰基-丙氨酰-谷氨酰胺的合成方法，包括如下步骤：(1)先将DES与水混合配成DES混合液，再将谷氨酰胺分散在DES混合液中，得到悬浊液；(2)将Z-ALA-OME溶解在乙醇中，配成浓度为0.3～3.0mmol/ml的溶液；(3)将步骤(1)所得悬浊液与三乙胺混合，搅拌溶解，再与含可溶性蛋白的木瓜蛋白酶粉和步骤(2)制得的溶液混合，在30-70℃下搅拌反应1-24h。本发明通过该方法合成Z-Ala-Gln产率较高，条件温和，且易分离纯化，操作简便，具有良好的工业价值。
【IPC分类】C12P21-02
【公开号】CN104862363
【申请号】CN201510161000
【发明人】娄文勇, 徐红, 麻丽莎, 林子超, 曹诗林
【申请人】华南理工大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年4月7日