最佳条件，海参组织蛋白酶样品配置的PH—般为3.5-8.5，配制终浓度为lmg/mL。步骤3)中，蛋白酶溶液一般取5-500微升，使用培养皿盖、保鲜膜等封闭蛋白酶液及胶原凝胶，小心转移至水浴锅、恒温培养箱等设备中，保持20-60°C条件酶解10-60min。所述步骤3中，酶解结束后应将平板迅速放入零下低温环境，以抑制酶解；之后测量酶解形成圆形凹陷的表面直径，统计分析直径数据，制作酶解曲线。
[0010]I)胶原蛋白凝胶制作
取冰冻鸡爪300g作为制作材料，加水1L，100°C熬制30min后，室温冷却沉淀，取下层溶液30mL置于50mL离心管7000rpm常温离心lOmin，使用针筒吸取中层溶液1mL并置于I个干净的烧杯容器中，混合均匀后检测固形物含量为24.7%，再分成两份，使用NaOH和HCl溶液分别调整PH值至8.5和6.0，取3mL溶液倒于直径4cm的塑料培养皿内，室温冷却凝结，完成胶原蛋白凝胶制作。
[0011]2)蛋白酶溶液配制
利用胰蛋白酶(国药，CAS:9002-07-7)作为蛋白酶标准品，以10mg/mL、lmg/mL、0.lmg/mL、0.0lmg/mL及0.0Olmg/mL等浓度进行溶解制备酶液(pH为8.5)，实验测试用的海参组织蛋白酶以lmg/mL进行配制(pH为6.0)。
[0012]3)酶解曲线制作
取50微升配制完成的标准蛋白酶及海参组织蛋白酶溶液，滴于胶原蛋白凝胶表面；加盖密闭后放置于37°C恒温水浴锅内进行恒温酶解；15min后迅速将酶解后的平板放入_20°C冰柜，冷却Imin后放于冰盒中，使用游标卡尺测量酶解形成圆形凹陷的表面直径，利用Spass和Sigmaplot等软件分析直径数据，制作酶解曲线。酶解前胶原蛋白状态和酶解后胶原蛋白状态请见图1。
[0013]4)海参组织蛋白酶活性分析
以海参组织蛋白酶酶解形成的凹陷直径数据比对标准蛋白酶酶解数据制作的酶解曲线，查找lmg/mL海参组织蛋白酶对应的标准蛋白酶浓度特征，换算查得海参组织蛋白酶活性相对值。测得海参组织蛋白酶的胶原蛋白酶解活性为国药胰蛋白酶(CAS:9002-07-7 )的12.4%。
[0014]尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。
【主权项】
1.海参组织蛋白酶的胶原酶解活性检测方法，其特征是:采用海参组织蛋白酶对胶原蛋白凝胶表面酶解产生的凹陷直径进行酶解活性评价。
2.根据权利要求1所述的海参组织蛋白酶的胶原酶解活性检测方法，其特征是:所述的检测方法具有如下步骤: 1)胶原蛋白凝胶制作:利用日常生活中常见的富含胶原蛋白食品原料作为制作材料，经过熬制、去脂肪、过滤去杂、PH值调整、固形物测定、倒板凝结步骤处理，制成胶原蛋白凝胶； 2)蛋白酶溶液配制:将蛋白酶标准品以1mg/mL、lmg/mL、0.lmg/mL、0.0lmg/mL及0.001mg/mL的浓度进行溶解制备酶液，测试用的海参组织蛋白酶采用所述的蛋白酶标准品配置的浓度之一进行配制； 3)酶解曲线制作:取少量配制完成的标准蛋白酶及海参组织蛋白酶溶液，滴于胶原蛋白凝胶表面；加盖密闭后恒温酶解；迅速将酶解后的平板放入低温环境，待冷却后，快速测量酶解形成圆形凹陷的表面直径，统计分析直径数据，制作酶解曲线； 4)海参组织蛋白酶活性分析:以海参组织蛋白酶酶解形成的凹陷直径数据比对标准蛋白酶酶解数据制作的酶解曲线，查找海参组织蛋白酶对应的标准蛋白酶浓度特征，换算查得海参组织蛋白酶活性相对值。
3.根据权利要求2所述的海参组织蛋白酶的胶原酶解活性检测方法，其特征是:所述的步骤I)中，富含胶原蛋白食品原料选自鱼皮或鸡爪或猪皮；所述熬制过程温度为85-125°C，熬制时间为5-30min，可通过离心及冷冻去除脂肪。
4.根据权利要求2所述的海参组织蛋白酶的胶原酶解活性检测方法，其特征是:所述的步骤I)中，可利用HCl和NaOH等酸碱进行溶液pH值调整，根据不同胶原蛋白原料特性，调整固形物浓度为10-50%，利用常用的盘碟、培养皿等作为倒板器皿。
5.根据权利要求2所述的海参组织蛋白酶的胶原酶解活性检测方法，其特征是:所述的步骤2)中，所使用的蛋白酶一般选择胶原蛋白酶解活性较强的复合酶作为标准品，所配制的酶液需调整PH至酶活性最佳条件，海参组织蛋白酶样品配置的pH —般为3.5-8.5，配制终浓度为lmg/mL。
6.根据权利要求2所述的海参组织蛋白酶的胶原酶解活性检测方法，其特征是:所述的步骤3)中，蛋白酶溶液一般取5-500微升，使用培养皿盖、保鲜膜等封闭蛋白酶液及胶原凝胶，小心转移至水浴锅、恒温培养箱等设备中，保持20-60°C条件酶解10-60min。
7.根据权利要求2所述的海参组织蛋白酶的胶原酶解活性检测方法，其特征是:所述步骤(3)中，酶解结束后应将平板迅速放入零下低温环境，以抑制酶解；之后测量酶解形成圆形凹陷的表面直径，统计分析直径数据，制作酶解曲线。
【专利摘要】本发明公开了海参组织蛋白酶的胶原酶解活性检测方法，包括，其中：采用海参组织蛋白酶对胶原蛋白凝胶表面酶解产生的凹陷直径进行酶解效果评价。对酶活性采用酶解直径或面积进行评价，能得到半定量的结果。可以满足大部分的酶活性评价需求，且较为准确。因而本发明有适用于海参蛋白酶、能半定量化评价海参组织蛋白酶的胶原酶解活性、原料获取便利的优点。
【IPC分类】C12Q1-37
【公开号】CN104862374
【申请号】CN201510241949
【发明人】王天明, 肖金星, 郑刚, 杨水兵, 余海霞
【申请人】浙江大学舟山海洋研究中心
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年5月12日