p53基因在逆转口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞恶性特征中的应用及其体外评价方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞和分子生物技术领域，具体涉及rAd-p53在逆转口腔粘膜恶性黑 色素瘤细胞恶性特征中的应用及其体外评价方法。 技术背景
[0002] 有研宄显示在东亚地区原发于头颈部的粘膜恶性黑色素瘤（主要位于口腔）常发 生于腭部和上颁牙龈，由于头颈部具有丰富的血供和淋巴引流系统，致使发生于该部位的 恶性黑色素瘤极易局部复发和远处转移，因而治疗困难且预后极差。口腔粘膜恶性黑色素 瘤细胞与其他肿瘤细胞相比其恶性程度更高，其治疗和预后更加困难，因此有"癌中之王" 之称。
[0003] 目前对口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞发病机制也并不十分清楚，由于口腔粘膜恶性 黑色素瘤细胞的特殊性，目前对转移性口腔粘膜恶性黑色素瘤患者还没有有效的长期治疗 方法。研宄发现，标准化疗方案也不能给患者带来显著的长期存活功效。在目前的技术条 件下，要开发治疗黑色素瘤的有效方法是极具挑战性的。对传统化疗剂和辐射的高度耐 受性是黑色素瘤的特点。现在研宄的目标的开始转向确定口腔粘膜恶性黑色素瘤基因突 变和信号转导通路的相关扰动，从而希望能开发出具有更好的有效性和更特异性的治疗 方法。目前，已经发现对细胞增殖、凋亡及耐药性或转移作用而言很重要的多种细胞通路 在口腔粘膜恶性黑色素瘤中均被激活。口腔粘膜恶性黑色素瘤可能导致包括调节功能缺 失或者产生抗细胞凋亡功能或增殖功能相关因素在内的多种缺陷（Smalley and Eisen， International Journal of Cancer ? 2003 ；S. CIOLOFAN etc.，Rom J Morphol Embryol ，2011)，虽然，目前对相关机制并不完全明确，但开发能够同时抑制多种信号传导通路的治 疗手段，有可能为口腔粘膜恶性黑色素瘤的治疗带来新的希望。
[0004] 基因治疗由于其独特的优势，有望从根本上遏制肿瘤的发展，目前正是肿瘤生物 治疗研宄的热点。然而，基因治疗作为一种新兴的癌症治疗方法，其技术尚不成熟，对不同 种类的癌症的抑制机理也并不明确，针对不同不同种类的癌症的治疗策略也不相同。尤其 是对于口腔粘膜恶性黑色素瘤，目前尚没有比较成熟的基因治疗手段，且目前对于口腔粘 膜恶性黑色素瘤细胞恶性特征逆转的表征方法也并不完善。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，本发明提供了一种p53基因在逆转口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞恶 性特征中的应用及其体外评价方法。所述应用和方法可用于口腔粘膜恶性黑色素瘤治疗手 段的初步研宄和评价。
[0006] 本发明通过以下技术方案来实现： 一种P53基因在逆转口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞恶性特征中的应用，将p53基因转染 到恶性黑色素瘤相关细胞株中。
[0007] 作为可选方式，在上述应用中，所述基因转染的方式为将装载了 p53基因的载体 与体外培养恶性黑色素瘤相关细胞株进行共培养或将装载了 P53基因的载体输送到恶性 黑色素瘤的肿瘤组织中与相关细胞进行接触转染。
[0008] 作为可选方式，在上述应用中，所述恶性黑色素瘤相关细胞株为人恶性黑色素瘤 细胞株（A-375)。
[0009] 作为可选方式，在上述应用中，所述P53基因为外源野生型P53基因，优选为人P53 基因。
[0010] 作为可选方式，在上述应用中，所述装载了 P53基因的载体为重组人p53腺病毒 (rAd-p53)〇 toon] 作为可选方式，在上述应用中，采用其他基因载体(可以是病毒载体也可以是非病 毒载体）代替腺病毒。
[0012] 作为可选方式，在上述应用中，将装载了 P53基因的载体制作成注射液，通过注射 方式将装载了 P53基因的载体输送到恶性黑色素瘤的肿瘤组织中与相关细胞进行接触转 染。
[0013] 作为可选方式，在上述应用中，通过改变恶性黑色素瘤相关细胞的形态，使其出现 典型的病理学变化，来抑制其生长，逆转其恶性特征。
[0014] 作为可选方式，在上述应用中，通过改变恶性黑色素瘤相关细胞的细胞周期，通过 Gl期阻滞效果，促进其凋亡，来进一步逆转其恶性特征。
[0015] 作为可选方式，在上述应用中，通过促进恶性黑色素瘤相关细胞中p53和p21GIP/WAF 的mRNA及蛋白的表达，以及抑制bcl-2的mRNA及蛋白的表达，来进一步逆转其恶性特征。
[0016] 作为可选方式，在上述应用中，通过抑制恶性黑色素瘤相关细胞内基质金属蛋白 酶MMP-9的表达，来逆转其转移，侵袭的恶性特征。
[0017] 本发明还提供了一种口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞恶性特征逆转的体外评价方法， 包括以下步骤：采用P53基因转染恶性黑色素瘤相关细胞株，然后对转染后的恶性黑色素 瘤相关细胞株的恶性特征逆转情况进行检测。
[0018] 作为可选方式，在上述体外评价方法中，采用装载了 P53基因的载体与体外培养 恶性黑色素瘤相关细胞株进行共培养实现接触转染。
[0019] 作为可选方式，在上述体外评价方法中，所述恶性黑色素瘤相关细胞株为人恶性 黑色素瘤细胞株（A-375)。
[0020] 作为可选方式，在上述体外评价方法中，所述P53基因为外源野生型P53基因，优 选为人P53基因。
[0021] 作为可选方式，在上述体外评价方法中，采用重组人p53腺病毒（rAd-p53)进行基 因转染。
[0022] 作为可选方式，在上述体外评价方法中，采用其他基因载体(可以是病毒载体也可 以是非病毒载体）代替腺病毒。
[0023] 作为可选方式，在上述体外评价方法中，还包括采用带有标记蛋白基因的相应 载体转染恶性黑色素瘤相关细胞株，检测载体对所述恶性黑色素瘤相关细胞株的转染效 率。作为可选，所述标记蛋白基因为荧光蛋白基因。作为可选方式，所述方法中还包括采 用带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒（rAd-GFP)转染恶性黑色素瘤相关细胞株，检测 腺病毒对所述恶性黑色素瘤相关细胞株的转染效率。作为可选方式，检测不同感染复数 (Multiplicity of Infection，MOI)条件（]\?1=0、25、50、100、200、500)下，载体的转染效 率，从而对MOI值进行筛选。优选M0I=100。
[0024] 作为可选方式，在上述体外评价方法中，所述恶性特征逆转情况检测包括检测转 染后的细胞增殖抑制率。检测不同感染复数（Multiplicity of Infection，Μ0Ι)条件 (M0I=0、25、50、100、200、500)下，进行p53基因转染所产生的细胞增殖抑制率，从而对MOI 值进行筛选。优选M0I=100。作为可选方式，采用MTT法或CCK-8法等方法对细胞增殖情况 进行定量检测。
[0025] 作为可选方式，在上述体外评价方法中，所述恶性特征逆转情况检测包括检转染 后细胞P53蛋白的表达。作为可选方式，采用免疫细胞化学染色法检测p53蛋白的表达。
[0026] 作为可选方式，在上述体外评价方法中，所述恶性特征逆转情况检测包括观察转 染后细胞的形态学变化。作为可选方式，采用倒置显微镜进行细胞的形态学观察，也可采用 扫描电镜或透射电镜等其他方式。
[0027] 作为可选方式，在上述体外评价方法中，所述恶性特征逆转情况检测包括检测细 胞周期及细胞凋亡率。作为可选方式，采用流式细胞仪进行细胞周期及细胞凋亡率检测。
[0028] 作为可选方式，在上述体外评价方法中，所述恶性特征逆转情况检测包括检测转 染细胞后P53和/或p21和/或bcl-2基因的mRNA及蛋白的表达变化。作为可选方式，采 用荧光实时定量PCR进行检测。
[0029] 作为可选方式，在上述体外评价方法中，所述恶性特征逆转情况检测包括检测转 染后细胞内基质金属蛋白酶MMP-9的表达。作为可选方式，采用免疫细胞化学染色法进行 检测。
[0030] 作为可选方式，在上述体外评价方法中，根据需要设置相应的对照。如设置空白对 照和/或阴性对照组或在转染前后分别进行相应的检测。具体对照组的设置是本领域技术 人员根据数据对比需要和本领域公知常识和现有技术可以灵活调整的。
[0031] 本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥 的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
[0032] 本发明的有益效果： 本发明将基因治疗方法用于口腔粘膜恶性黑色素瘤细胞恶性特征的逆转及其体外评 价中，通过向恶性黑色素瘤相关细胞株中引入外源野生型P53基因，可以通过多种机制，依 靠多种信号传导通路的综合作用，在抑制细胞增长的同时改变细胞周期分布并诱导细胞发 生凋亡，且逆转其转移，侵袭的恶性特征。所述评价方法，简单可靠且科学合理，能够对口腔 粘膜恶性黑色素瘤细胞恶性特征的逆转情况进行全面的检测，可用于口腔粘膜恶