专利名称：香烟危害易感基因检测方法
技术领域：
本发明涉及一种利用现代生物技术检测“香烟危害易感基因”的方法。该技术通过人体的几根头发(或口腔粘膜细胞)提取DNA，再通过TAQMAN-MGB技术探针结合实时荧光定量PCR技术检测检测“香烟危害易感基因”的多态性，能检测和分析受试者是否携带“香烟危害易感基因”，反映受试者体内基因对吸烟的敏感性，将肺癌易感人群从人群中筛选出来，提示消费者易患肺癌的概率有多大，指导消费者采取健康的生活和卫生习惯，达到预防疾病的目的。
指导消费者采取健康的生活和卫生习惯。
吸烟(包括环境性吸烟，或称被动吸烟)是人类已知的最重要的致癌因素之一。根据WHO的报告，全球约1/3的(11亿)成年人吸烟，其中2亿为女性。约1/3的癌症与吸烟有关，其中80％～90％的肺癌发生与吸烟关系更密切。最近的研究资料表明，美国1995年约15.7万人死于肺癌，特别是女性肺癌死亡率明显上升。在英国，吸烟使每年死于肺癌者增加数百人。目前，我国有3亿多吸烟者和4亿多被动吸烟者，且青少年吸烟率迅速上升，已成为世界上因吸烟致死人数最多的国家，其中肺癌死亡率正以每年4.5％～10％的速度递增。
早在1997年10月在Betaesda举行的环境基因组计划(EGP)学术会议上就提出环境因素与遗传因素间的相互作用对人类健康十分重要。同年11月Science杂志上发表一篇文章Environment and CancerWho Are Susceptible？该论文在大量的生物学研究报道基础上证明，大量的肿瘤患者是易感人群，在致癌环境中容易导致癌症；如果通过控制环境、改变饮食等生活习惯，有可能避免癌症的发生。
1998年4月4日，环境基因组计划由美国国会顾问环境卫生科学委员会正式投资专项基金进行研究，先期投入6千万美元，计划2004年完成。参加的机构主要有美国国立环境卫生科学研究所、美国国立卫生院的几个研究所、美国能源部以及联邦研究机构。
人类健康状况受多种因素影响，如遗传易感性、环境的暴露和衰老等。快速发展的分子遗传学使人们认识到对环境暴露(如主动或被动吸烟)的易感性存在不同个体遗传背景的差异。研究肿瘤易感性(cancer susceptibility)的主要目的是将易感人群从人群中筛选出来，对他们进行肿瘤I级预防(病因学预防)以降低肿瘤(如肺癌)的发生率和死亡率。
研究表明，约90％的肿瘤发生可能与环境致癌因素有关，人群对各种致癌因子的反应存在明显的差异。这种个体肿瘤易感性差异主要是由于肿瘤易感基因的遗传多态性所决定。吸烟是发生肺癌的基本病因和主要危险因素，对美国、英国、加拿大等国100万以上人群进行的7次大规模调查统计资料显示，吸烟者肺癌的发病率是不吸烟者的10.8倍。
体内参与代谢活化致癌物的酶或解毒致癌物的酶的活性决定了机体对致癌物的敏感性或遗传易感性。机体I、II相反应的代谢酶类的功能是将进入体内的药物、色素、毒素、代谢产物等脂溶性较高的化合物转变为极性较强的亲水性产物，以便排出体外。I相代谢酶可激活进入体内的外源性致癌物质，如细胞色素P450酶(CYP450)可催化许多存在于烟草中的原致癌物，变成终致癌物。而II相代谢酶，如谷胱甘肽硫转移酶(GST)，能与I相代谢酶修饰后的终致癌物相结合，结合后的复合物可溶性增加，易被机体排泄掉。CYP450和GST分别是细胞内重要的□相和□相代谢酶，在致癌物的活化和解毒过程中起重要作用。
CYP1A1定位于染色体15q22-q14，编码芳烃羟化酶(AHH)。该基因第7外显子的点突变导致第462号密码子Ile→Val的改变，引起三种多态性CYP1A1(I/I)、CYP1A1(I/V)、CYP1A1(V/V)。研究表明，其多态性与多种肿瘤易感性相关。在肺癌，CYP1A1(V/V)基因型个体肿瘤易感性增高。
GST基因家族分为α、μ、π、θ四型，GSTM1基因是其中的一个亚型，定位于染色体1p13，有GSTM1a、GSTM1b、GSTM1(-)三个等位基因，其中GSTM1(-)是空白等位基因。GSTM1负责对苯并芘代谢的活性产物-环氧或羟化物的解毒，GSTM1(-/-)基因型个体缺乏GST酶活性，失去了解毒功能，增加个体患癌的危险性。
因此，GSTM1(-/-)基因型和CYP1A1(V/V)基因型是影响肿瘤易感性的重要基因型。
此外，p53基因是一种抑癌基因，是目前人类肿瘤中最常发生变化的基因。它位于染色体17p13.1上，编码53KD的核磷酸蛋白，此蛋白通过p21蛋白参与细胞周期的调控，对细胞的分裂和增殖起负调节作用。若突变，则最终使细胞生长和分化的调节失控，导致细胞的持续分裂和癌变。在许多恶性肿瘤中均发现有p53基因的异常，肺癌为50％-70％人的患者发生P53基因突变，主要在高度保守区内，以175、248、249、273位点突变率最高。
所以，同时检测代谢酶基因分型和癌基因分型对预测、比较个体的肿瘤易感性具有重要意义。本发明中，与肺癌易感、发生密切相关的代谢酶基因和癌基因称为“香烟危害易感基因”。
另一方面，实时荧光定量PCR技术是一种先进的基因检测方法。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决传统PCR方法的污染问题、并且具有自动化程度高等优点。
本发明采用实时荧光定量PCR技术中已成熟的Taqman技术，该技术合成一段在5’端和3’端分别带有荧光报告基团(R)和淬灭基团(Q)的特异性探针，当PCR扩增时在加入一对引物的同时加入荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
本发明采用TAQMAN-MGB技术同时检测上述三个基因多态性(SNP)。TaqMan-MGB探针的优势(1)提高Tm，探针更短(尤其对AT含量高的序列)，提高配对与非配对Tm差异，减少检测假阳性；(2)提高信噪比，无背景荧光，空间距离近，更好的淬灭效果，单点突变检测灵敏度相对提高。
本发明的目的是利用TAQMAN-MGB技术探针和实时荧光定量PCR技术检测和分析人群是否携带“香烟危害易感基因”，将肺癌易感人群从人群中筛选出来，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。
为实现上述发明目的，本发明按下列实施例操作1、DNA提取取测试者口腔粘膜细胞或提取正常人外周血白细胞(正常对照)，分别加入适量DNA抽提液和蛋白酶K(80μg/ml)，55℃消化3h。酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次，乙醇沉淀、70％乙醇洗涤晾干后，溶于适量10mmol/L Tris-Cl，1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液中。
2、PCR扩增取测试者和正常对照(已知野生型)各取三份上述提取液加入96孔板(样本量大时使用384孔板)中，分别进行PCR扩增。
(1)GSTM1基因分型PCR反应总体积50μl，其中200μmol/L dNTPs，10×PCR Buffer 5μl，1.5mmol/L MgCl2，模板DNA 0.2μg，引物P1 600ng，P2 300ng，P3 300ng，矿物油30μl。96℃预变性6min，加入Taq DNA聚合酶1.5U后，置于PCR仪上反应94℃40s，52℃60s，72℃50s，35个循环；72℃6min。
GSTM1扩增引物P15′-CGC CAT CTT GTG CTA CAT TGC CCG-3′
P25′-ATC TTC TCC TCT TCT GTC TC-3′P35′-TTC TGG ATT GTA GCA GAT CA-3′(2)CYP1A1基因分型PCR反应总体积为50μl，其中加入模板DNA100ng-600ng，1μmol/L引物，200μmol/L dNTPs，1.5mmol/LMgCl2和适量10×PCRBuffer，用50μL液体石蜡油封盖。95℃预变性5min，冰水浴上加Taq DNA聚合酶2.5U，热循环参数为94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸10min。
CYP1A1扩增引物P45′-GAA CTG CCA CTT CAG CTG TCT-3′P5a5′-AAG ACC TCC CAG CGG GCA AT-3′P5b5′-AAG ACC TCC CAG CGG GCA AC-3′(3)p53基因分型PCR反应总体积为50μl，其中加入模板DNA100ng-600ng，1μmol/L引物，200μmol/L dNTPs，1.5mmol/LMgCl2和适量10×PCR Buffer，用50μL液体石蜡油封盖。95℃预变性5min，冰水浴上加Taq DNA聚合酶2.5U，热循环参数为94℃变性1min，50-62℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环后72℃延伸10min。
p53各外显子的PCR扩增引物Exon55′-ACT CAA TTT CCC TCA ATA AG-3′5′-CAC CAT CAG AGC AAC GCT CA-3′Exon65′-TAT TCT TGC TCT TAG GCC TG-3′5′-GAG TCT TCC AGC GTG ATG AT-3′Exon75′-GTG GTA CCG TAT GAG CCA CC-3′5′-CAA CCT GGC ACA CAG CTT CC-3′Exon85′-TGT GCT GTG CCT GGT GTT GTC-3′5′-GCG CCT CCA CCT TCT TTG TCC-3′
同时，在上述三个反应体系加入各自的TAQMAN-MGB探针，该探针的设计按ABI Primer Express2.0 software的设计原则进行，如多态位点尽量位于探针中央；引物要尽可能地接近探针，但是不要重叠；保持G-C含量在20-80％之间等。
3、结果分析经荧光定量PCR仪检测，通过和野生型(正常对照)比对，如果相关探针最终出现荧光信号，那就可以判断为相关点发生突变，成为“吸烟危害易感基因”。上述三个基因的位点都发生突变，理论上患肺癌的概率最高；二个基因的位点发生突变，次之；一个基因的位点发生突变，理论上患肺癌的概率最小。
对于吸烟者，如果携带“吸烟危害易感基因”，要立即戒烟。对于被动吸烟者，如果携带“吸烟危害易感基因”，要远离烟雾环境。对于将要加入烟民行列的人，如果“吸烟危害易感基因”，对香烟要敬而远之。了解体内基因信息，决定自己健康的生活方式！
权利要求
1.一种利用现代生物技术检测“香烟危害易感基因”的方法。具体涉及一种先进的基因检测方法实时荧光定量PCR技术检测和分析“香烟危害易感基因”的多态性位点。
2.根据权利要求1所述的“香烟危害易感基因”，其特征在于它特指三个与肺癌关系最密切的基因CYP450基因、GST基因及抑癌基因P53。
3.如权利要求1所述的实时荧光定量PCR技术，其特征在于它利用TaqMan-MGB探针结合实时荧光定量PCR技术，同时检测上述三个基因中与肺癌密切相关的SNP位点。
4.根据权利要求2所述的“香烟危害易感基因”，其特征在于CYP450基因的第7外显子CYP1A1有三种多态性位点，GST基因家族的一个亚型GSTM1基因有三个等位基因，P53基因第五至第八个外显子上175、248、249、273位点。检测针对这些SNP位点。
5.如权利要求4所述的“香烟危害易感基因”，其特征在于用TaqMan-MGB探针和实时荧光定量PCR技术检测上述三个基因的各个位点。若上述三个基因的位点都发生突变，理论上患肺癌的概率最高；二个基因的位点发生突变，次之；一个基因的位点发生突变，理论上患肺癌的概率最小。
全文摘要
本发明涉及一种利用现代生物技术检测“香烟危害易感基因”的方法。该技术通过人体的几根头发(或口腔粘膜细胞)提取DNA，再通过TAQMAN－MGB技术探针结合实时荧光定量PCR技术检测检测“香烟危害易感基因”的多态性，能检测和分析受试者是否携带“香烟危害易感基因”，反映受试者体内基因对吸烟的敏感性，将肺癌易感人群从人群中筛选出来，指导消费者采取健康的生活和卫生习惯，达到及时预防疾病的目的。
文档编号C12Q1/68GK1664111SQ20041001674
公开日2005年9月7日 申请日期2004年3月5日 优先权日2004年3月5日
发明者肖自力, 郁涵, 李自明, 崔春黎 申请人:肖自力, 上海仁通生物科技有限公司