1型糖尿病易感位点rs231775的检测方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测1型糖尿病易感位点的方法及试剂盒，所述方法包括如下步骤：(1)提取样品的基因组DNA，扩增样品的CTLA-4基因外显子中包含rs231775位点的区域，得到扩增产物；(2)使用HRM分析技术检测扩增产物中SNP位点的基因型。采用HRM分析技术对扩增后的CTLA-4基因外显子中包含rs231775位点的区域进行基因型分析，该方法操作简单、快速，使用成本低，结果准确，可以实现批量检测；使用上述试剂盒可以清晰的判断受检人群是否携带1型糖尿病易感基因，将1型糖尿病易感人群从人群中筛选出来，改变不良的生活习惯，达到预防的目的。
【专利说明】1型糖尿病易感位点rs231 775的检测方法及试剂盒 【【技术领域】】
[0001] 本发明涉及一种1型糖尿病易感性的检测方法及试剂盒，更具体的说是 通过测定与1型糖尿病相关基因细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cyt〇t〇Xic T lymphocyte_associatedantigen4，CTLA-4)的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP)预测受试者对于1型糖尿病的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断、 治疗和新药开发，属于分子生物学和医学领域。 【【背景技术】】
[0002] 糖尿病是常见病、多发病，其患病率正随人民生活水平的提高、人口老化和生活方 式的改变迅速增加。据世界卫生组织（WHO)估计，全球目前有超过1.5亿糖尿病患者，到 2025年这一数字将增加一倍。我国现有糖尿病患者3千万，居世界第2位。糖尿病已成 为发达国家中继心血管病和肿瘤之后的第三大非传染性疾病，对社会和经济带来沉重的负 担，是严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。根据WHO和国际糖尿病联盟（IDF)专家 组的建议，糖尿病可分为1型、2型、其他特殊类型及妊娠糖尿病四种。研究表明，1型糖尿 病占糖尿病总发病人数的1 %?10%，且近年来该病的发病率呈逐年上升趋势。
[0003] 糖尿病的病因和发病机制较为复杂，至今尚未完全明了。目前认为1型糖尿病 (type I diabetes，TlDM)是一种在遗传与环境相互作用下，以T细胞介导的特异性胰岛β 细胞自身免疫性破坏为主要发病机制的一种疾病。1型糖尿病具有多基因遗传背景，易感性 十分复杂，疾病的发生是多种基因相互作用、相互影响的结果。近年来，随着对1型糖尿病 相关基因的研究日趋深入，证实了多种基因在1型糖尿病的发生发展中的作用，为1型糖尿 病的早期诊断和治疗提供了理论依据。
[0004] 细胞毒性Τ淋巴细胞相关抗原4基因位于染色体2q33,编码Τ细胞表面的一种膜 蛋白。研究表明，只有激活的T细胞才表达CTLA-4分子，并与抗原递呈细胞膜上的B7分子 结合，传递负性调节信号，终止T细胞活化和抑制免疫反应的进行，对T细胞增生起负性调 节作用。研究表明CTLA-4基因外显子I第17密码子49位点A/G多态性（rs231775)，导 致CTLA-4信号肽区域内的苏氨酸变为丙氨酸，与机体免疫应答的过度激活相关，是1型糖 尿病的独立危险因素之一。
[0005] 现有技术检测1型糖尿病易感人群，采用杂交芯片法或玻璃板芯片法，以及采用 taqman探针，前两种方法准确率低、假阴性和假阳性率较高，且不能批量检测；另一种直接 测序法虽然准确率高，但其成本也很高，同样很难实现批量检测。
[0006] 因此，有必要提出一种新的检测方法以解决上述问题。 【
【发明内容】
】
[0007] 本发明的主要目的是提供一种辅助诊断1型糖尿病的方法，该方法操作简单、快 速，使用成本低，结果准确，可以实现批量检测。
[0008] 本发明的另一目的是提供一种用于检测1型糖尿病易感位点的试剂盒，该试剂盒 包括PCR引物及含有该引物的试剂盒，其可以实现扩增与HRM分析。
[0009] 为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是：一种检测1型糖尿病易感位点的 方法，包括如下步骤：（1)提取样品的基因组DNA，扩增样品的CTLA-4基因外显子中包含 rs231775号位点的区域，得到扩增产物；（2)使用HRM分析技术检测扩增产物中SNP位点的 基因型。
[0010] 进一步的，CTLA-4基因的rs231775位点的基因型带有GG时，该CTLA-4基因所属 样品的测试者对于1型糖尿病的易感性高于基因型不带GG的测试者。
[0011] 进一步的，使用特异性引物扩增样品的CTLA-4基因外显子中包含rs231775位点 的区域，该特异性引物是指针对CTLA-4基因上rs231775号SNP位点而设计，能特异性扩增 出包含上述SNP位点的DNA片段的引物对。
[0012] 进一步的，所述特异性引物具有SEQ ID N0 :2和SEQ ID N0 :3所示的核苷酸序列。
[0013] 进一步的，使用HRM分析技术直接检测扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的引 物对的基因型。
[0014] 进一步的，将扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的引物对转移至分析装置，然后 使用HRM分析技术对该引物对的基因型进行分析。
[0015] 进一步的，所述1型糖尿病易感位点的检测方法在体外非诊断性检测1型糖尿病 易感性方面的应用。
[0016] 为了解决上述问题，本发明采用的另一技术方案是：一种用于检测1型糖尿病易 感位点的试剂盒，其可以对CTLA-4基因外显子中包含rs231775号位点的区域进行扩增及 HRM技术分析。
[0017] 进一步的，所述试剂盒包括特异性扩增CTLA-4基因外显子中包含rs231775位点 的区域的特异性引物。
[0018] 进一步的，所述特异性引物具有SEQ ID N0 :2和SEQ ID N0 :3所示的核苷酸序列。
[0019] 进一步的，试剂盒的组分及含量包括5ul2X LightCycler480High Resolution Melting Master Mix、1.2ul25mM MgC12 溶液、lul2 μ M Primer Mix、lul5ng/μ 1 左右 DNA、 1.8ul H20、具有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的特异性引物。
[0020] 进一步的，所述试剂盒在检测1型糖尿病易感性方面的应用。
[0021] 与现有技术相比较，本发明具有以下优点：采用HRM分析技术对扩增后的CTLA-4 基因外显子中包含rs231775位点的区域进行基因型分析，该方法操作简单、快速，使用成 本低，结果准确，可以实现批量检测。 【【专利附图】
【附图说明】】
[0022] 图1是CTLA-4基因 rs231775位点基因型的HRM检测结果；
[0023] 图2是Tapman探针法截图，显示了 rs231775的一种SNP基因型的探针检测结果。 【【具体实施方式】】
[0024] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件如Sambrook等人、分子克隆、实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照厂商所建议的条件。
[0025] 本发明提供了一种1型糖尿病易感位点的检测方法及试剂盒，所述方法包括如下 步骤：（1)提取样品的基因组DNA，扩增样品的CTLA-4基因外显子中包含rs231775号位点 的区域，得到扩增产物；（2)使用HRM分析技术检测扩增产物中SNP位点的基因型。该1型 糖尿病易感位点的检测方法及检测试剂盒还可以用于检测1型糖尿病的易感性。
[0026] 所述的rs231775位于CTLA-4的外显子中（片段重叠群contig :ΝΤ_005403· 17位 置54942132A>G)，其中，脱氧核糖核酸（DNA)序列编号：rs231775位置基于SEQ ID Ν0:1 所示的核苷酸序列；引物1基于SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列；引物2基于SEQ ID NO : 3所示的核苷酸序列；扩增产物3基于SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。
[0027] 经过多年研究证明了 CTLA-4基因单核苷酸多态性位点rs231775与1型糖尿病密 切相关，而且发现了它的新功能：CTLA-4基因单核苷酸多态性位点rs231775位于CTLA-4 外显子中的基因型的改变将导致1型糖尿病的发病风险升高，其中关联研究结果显示，在 CTLA-4基因 rs231775A - G在病例和对照组中的分布存在显著性差异（p < 0. 05)，该SNP 多态性可改变转录因子结合位点。
[0028] CTLA-4基因的详细序列可参见登录号为rs231775的核苷酸序列（可参见网址 http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/) 〇
[0029] 实施例1 :突光PCR检测
[0030] 一、实验材料
[0031] LightCycler480荧光定量PCR仪购自瑞士罗氏（Roche)公司，聚合酶链反应液 (LightCycler480High Resolution Melting Master)由瑞士罗氏（Roche)公司定制合成。 [0032] 二、引物及探针设计与合成：
[0033] 以CTLA-4基因外显子的部分序列为模板，使用Primer Premier5软件分析引物， 并由上海生工生物工程有限公司定制合成。
[0034] 检测用引物：
[0035] CTLA-4 基因 rs231775 上游引物序列：5' -CTTGGATTTCAGCGGCACA-3' (SEQ ID NO ：2)
[0036] CTLA-4基因 rs231775下游引物序列：5'-
[0037] GAAGAGAAGAAAAAACAGGAGAGTG-3, (SEQ ID NO :3)
[0038] 三、样本检测：
[0039] 实验共检测50例1型糖尿病病例和50例正常对照人群，每例收集血样标本约 2ml，用酚/氯仿抽屉基因组DNA，抽提结果用微量紫外/可见光分光光度计（Thermo Fisher 公司）检测。
[0040] 按如下体系进行突光PCR扩增，最后用roche lc480softwarel. 5扫描并聚类分析
[0041]
【权利要求】
1. 一种1型糖尿病易感位点的检测方法，其特征在于：包括步骤： ⑴提取样品的基因组DNA，扩增样品的细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)基因 外显子中包含rs231775位点的区域，得到扩增产物；和 (2)使用高分辨烙解曲线（high-resolution melt，HRM)分析技术检测扩增产物中单 核苷酸多态性（SNP)位点的基因型。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：CTLA-4基因的rs231775位点的基因型带有 GG时，该CTLA-4基因所属样品的测试者对于1型糖尿病的易感性高于基因型未带有GG的 测试者。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于：使用特异性引物扩增样品的CTLA-4基因外 显子中包含rs231775位点的区域，该特异性引物是指针对CTLA-4基因上rs231775号SNP 位点而设计，能特异性扩增出包含上述SNP位点的DNA片段的引物对。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述特异性引物具有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于：使用HRM分析技术直接检测扩增后包含上 述SNP位点的DNA片段的引物对的基因型。
6. 如权利要求3所述的方法，其特征在于：将扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的 引物对转移至分析装置，然后使用HRM分析技术对该引物对的基因型进行分析。
7. -种用于检测1型糖尿病易位点的试剂盒，其特征在于：对CTLA-4基因外显子中包 含rs231775号位点的区域进行扩增及HRM技术分析。
8. 如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括特异性扩增CTLA-4基因 外显子中包含rs231775位点的区域的特异性引物。
9. 如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物具有SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。
10. 如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒的组分及含量包括5ul2X LightCycler480High Resolution Melting Master Mix、1.2ul25mM MgC12 溶液、lul2 μ Μ PrimerMix、lul5ng/μl左右DNA、l·8ulH20、具有SEQIDN0:2和SEQIDN0 :3所示的核 苷酸序列的特异性引物。
【文档编号】C12Q1/68GK104059989SQ201410331380
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】黄迅威, 张天竹, 沈玲宇, 邵敏华 申请人:光瀚健康咨询管理(上海)有限公司