重组ulp1激酶的编码序列、编码蛋白、含有该编码序列的质粒、及重组ulp1激酶的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组ULP1激酶的编码序列、编码蛋白、含有该编码序列的质粒、及重组ULP1激酶的制备方法。本发明通过使用自动诱导培养基与含有cspA启动子的表达载体相结合的异源表达方法，实现对UPL1蛋白的高活性的重组表达以及高纯度的富集。本发明在诱导UPL1基因表达时，无需监测OD600，最后能够通过一步法获得纯度在90％以上的UPL1蛋白。同时该方法在16度至37度这个温度范围内对ULP1蛋白均有稳定的表达效果，且最终产量均在15mg/L以上。纯化的ULP1蛋白具有高活性，能够在比较宽泛的条件下有效的将底物切割。
【专利说明】重组ULP1激酶的编码序列、编码蛋白、含有该编码序列的 质粒、及重组ULP1激酶的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学【技术领域】，具体涉及一种重组ULP1激酶的编码序列、编码 蛋白、含有该编码序列的质粒、及重组ULP1激酶的制备方法。
【背景技术】
[0002] 多肽或者蛋白质在大肠杆菌中的融合表达是非常常见的技术，但是为了将目的多 肽或者蛋白从融合蛋白中释放出来，往往需要使用价格不菲的蛋白激酶或者利用内含肽的 自断裂。内含肽的自断裂对目的多肽的N端或C端的第一个氨基酸有偏好性，且断裂效果 不稳定，因此目前主要是使用各类蛋白激酶来切割融合蛋白，从而释放出目的多肽（蛋白 质）。
[0003] 目前常见的切割融合蛋白的蛋白激酶有凝血酶，因子10蛋白，肠激酶，TEV激酶， PreScission激酶，TAGZyme激酶，HRV3C激酶，ULP1激酶。不过考虑到切割产物是否会产生 多余氨基酸、切割效率、以及切割位点的特异性这三方面因素，我们发现只有肠激酶与ULP1 激酶符合该条件。肠激酶是识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys结构，而ULP1激酶却是识别100个 氨基酸的SUM0标签形成的二级结构，因此ULP1激酶具有更好的切割特异性。同时SUM0标 签除了作为ULP1激酶的切割识别位点，也可以做为助溶标签使用，可以减小整个融合蛋白 的长度。综合以上的结论，我们认为ULP1激酶是目前为止最优的蛋白切割酶类，具有最好 的切割活性以及切割位点的特异性。通过调研国内相关专利，我们发现国内还没有ULP1激 酶制备的相关专利。国外相关文献中，虽然有相关报道，但是其制备工艺较为复杂而且纯度 较低。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种重组ULP1激酶的编码序列、编码蛋 白、含有该编码序列的质粒、及重组ULP1激酶的制备方法。
[0005] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0006] 所述重组ULP1激酶的编码序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 所述质粒含有SEQ ID NO. 1所示的编码序列，优选地，所述质粒为p⑶-ULP1，其全 序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0008] 所述蛋白序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0009] 所述重组ULP1激酶的制备方法包括如下步骤：
[0010] (1)根据大肠杆菌密码子使用偏好，对ulpi__621)这部分蛋白所对应的编码基因 进行优化，优化设计并合成后的编码序列如SEQ ID NO. 1所示；将SEQ ID NO. 1所示的序列 通过酶切方式接入表达载体pCold-II，得到质粒pCD-ULPl ;
[0011] 通过分析国内外文献，我们发现来自于酿酒酵母的ULP1激酶一共含有621个氨基 酸，但是只需要保留403-621这一区域的氨基酸，即可保留该激酶对SUM0标签的特异性识 别与切割活性，本发明所涉及的ULP1激酶制备均是指403-621这部分活性区域的制备；
[0012] (2)将质粒PCD-ULP1转入大肠杆菌，37°C倒置培养过夜；
[0013] (3)挑取单菌落至505培养基，于37°C条件下进行种子培养7 - 9h ;
[0014] (4)将种子培养基接入5052培养基，接种量为0· 08 - 1. 2%，于16 - 37°C诱导培 养16 - 72h后离心收集菌体；
[0015] (5)将收集的菌体超声破碎后过镍柱纯化：首先过PBS平衡镍柱，然后用咪唑洗脱 重组的ULP1激酶，再将洗脱出的重组ULP1激酶脱盐并收集保存。
[0016] 优选地，步骤（2)所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)，也可以为其他本领域常用 的其他菌种。
[0017] 步骤（3)种子培养时的摇床转速为220rpm。
[0018] 步骤⑷所述离心条件是4°C、5000rpm、离心30min。
[0019] 所述步骤（5)是将收集的菌体用PBS悬浮，然后将悬浮的菌体在功率30%、开5s 停12s条件下超声破碎30min，再将破碎后的菌体于4°C、15000rpm条件下离心30min后过 镍柱纯化。所述咪唑洗脱是用50mM咪唑和200mM咪唑各洗脱一次后再用400mM咪唑洗脱； 然后将洗脱液加入超滤管中，于4°C、5000rpm条件下离心30min进行脱盐。
[0020] 上述 505 与 5052 培养基配方参见 Protein Expr Purif41, 207-234. (2005)。
[0021] 本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规操作技术，文中没有特 别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科 技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0023] 通过使用自动诱导培养基与含有cspA启动子的表达载体相结合的异源表达方 法，实现对UPL1蛋白的高活性的重组表达以及高纯度的富集。该方法在诱导UPL1基因表 达时，无需监测〇D_ (常规技术中，一般是菌生长到0D值在0. 6附近时加入IPTG进行诱 导。而本发明由于使用自动诱导培养基，既不需要检测诱导时间，也不需要人工在特定时间 点加入诱导物），最后能够通过一步法获得纯度在90%以上的UPL1蛋白。同时该方法在16 度至37度这个温度范围内对ULP1蛋白均有稳定的表达效果，且最终产量均在15mg/L以 上。纯化的ULP1蛋白具有高活性：lul酶在30°C条件下能够切割5ug底物，能够在比较宽 泛的条件下有效的将底物切割。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为质粒p⑶-ULP1结构示意图；
[0025] 图2为不同温度下重组ULP1激酶的表达分析；其中，图A为ULP1在37度下进行 诱导表达；M，表示的是蛋白marker ;泳道1，505培养基的菌体（未诱导组）；泳道2,5052培 养基诱导培养的菌体（诱导组）；泳道3,超声破碎后离心得到的上清；泳道4,超声破碎后 离心得到的沉淀；泳道5,流穿镍柱后得到的滤液；泳道6, 200mM咪唑冲洗镍柱所洗脱的蛋 白；泳道7,200mM咪唑冲洗后再用400mM咪唑洗脱得到的蛋白样品；图B为ULP1在16度 下进行诱导表达；M，表示的是蛋白marker ;泳道1，505培养基的菌体（未诱导组）；泳道2， 5052培养基诱导培养的菌体（诱导组）；泳道3,超声破碎后离心得到的上清；泳道4,超声 破碎后离心得到的沉淀；泳道5,流穿镍柱后得到的滤液；泳道6, 200mM咪唑冲洗镍柱所洗 脱的蛋白；泳道7, 200mM咪唑冲洗后再用400mM咪唑洗脱得到的蛋白样品；箭头所指示的 位置为重组ULP1激酶；
[0026] 图3为重组ULP1激酶在不同环境下的切割效率；其中，Μ为蛋白marker ;泳道1 为阴性对照，只有5 μ g底物，无重组ULP1激酶；泳道2-10,均含有5 μ g底物，1 μ 1重组 ULP1激酶；泳道1-7均是采用标准的酶切缓冲液；泳道8-10采用的酶切缓冲体系分别是 Tris-HCl，roS，去离子水；泳道1，2,8,9,10是标准反应体积，即总反应体积是50μ 1 ;泳道 3,4, 5,6, 7 的反应体积分别是 100, 200,400,600, 800 μ 1。
【具体实施方式】
[0027] 实施例1重组ULP1激酶的制备流程
[0028] 1、根据大肠杆菌密码子使用偏好，对ULP1__621)这部分蛋白所对应的编码基因进 行优化。具体优化序列见SEQ ID N0. 1，序列末端引入6xHis标签。
[0029] 2、将SEQ ID NO. 1所对应的序列进行全基因合成，并将合成的SEQ ID NO. 1通过 酶切（Nde I和Hind III)连接的方式连接入商品化的表达载体pCold-II (该载体在Nde I 前端自带有6xHis序列），命名为p⑶-ULP1，序列如SEQ ID NO. 2所示。如图1所示，此时 ULP1激酶的N和C两端都带有6xHis标签（6xHis-ULPl(4Q3_621)-6xHis)，具有这种结构的重 组ULP1激酶对镍柱有着非常高的亲合力，因此可以用200mM的咪唑进行杂蛋白洗脱，最后 用400mM的咪唑进行重组ULP1激酶的洗脱，以此获得高纯度的目的产物。本策略最终所 制备的重组ULP1激酶对应的蛋白序列，除了含有ULP1激酶序列本身，还含有N端13个载 体所提供的氨基酸以及C末端的6个组氨酸标签，参见SEQ ID N0. 3 (非ULP1激酶序列均 下划线标出）。
[0030] 3、将质粒pCD-ULPl转入大肠杆菌BL21 (DE3)，37度倒置培养过夜。
[0031] 4、次日挑取单菌落至3mL505培养基（505与5052培养基配方，参见Protein Expr Purif41，207-234. (2005))，37 度 220rpm，进行种子培养基的富集。
[0032] 5、大约培养8小时后，取0. 5mL种子培养基，转入500mL5052培养基，然后选取合 适温度（16 - 37°C )进行自动诱导，诱导时间根据诱导温度确定，一般16°C需要诱导72小 时，而37°C是16小时，以菌0D6(?处于平台期为宜（即0D_读数不再增加）。从此步骤开 始，开始取样以备SDS-PAGE跑胶来监测实验过程。
[0033] 6、4°C, 5〇OOrpm,离心3〇分钟收集菌体。
[0034] 7、使用100ml PBS悬浮菌体，取50ml悬浮液体放入超声小杯中。超声波功率为 30 %，超声开5s，停12s，总时间为30分钟。破碎后的样品在4°C，15000rpm离心30分钟后， 取上清，准备进行镍柱纯化。
[0035] 8、首先用30ml的PBS平衡镍柱，然后将上一步的上清过柱3次，接着分别用 30ml50mM咪唑和200mM咪唑冲洗杂蛋白各一次，最终用400mM洗脱重组的ULP1激酶。
[0036] 9、将400mM的ULP1激酶洗脱液加入超滤管（截留分子量为10kDa)进行脱盐，在 4度5000rpm离心30分钟后，收集超滤管中脱盐后的ULP1激酶，最后加入10ml储存液使 ULP1激酶能够长时间在-80°C保存。
[0037] 通过上述方法获得纯度在90%以上的UPL1激酶蛋白，产量在15mg/L以上。
[0038] 实施例2不同温度对重组ULP1激酶异源表达的影响
[0039] 发明人同时摸索了不同温度下，重组ULP1激酶在大肠杆菌中的表达情况。发现重 组ULP1激酶在非常宽泛的温度下（16-37度）均有很好的表达效果（图2)，这意味着研究 人员可以根据实验进度的需要来选择合适的温度。图2中展示了 16度与37度下重组ULP1 激酶的表达情况，发现这两个温度下，重组ULP1激酶的均能够很明显的得到表达。同时发 明人还摸索了其他温度例如30度，25度，20度等，其结果与37度基本一致。温度越低，菌 体生长越慢，因此诱导时间会随着温度降低而延长，最终收获菌体的依据是以〇D_读数不 再增加，即菌体进入平台期。
[0040] 实施例3重组ULP1激酶的活性检测
[0041] 发明人比较了该重组ULP1激酶在不同条件下的切割效率，如图3所示，发现本 方法制备的重组ULP1激酶在其切割的标准缓冲液、Tris-HCl、PBS缓冲液，甚至纯水中 均有非常高的活性，能够完全切割底物蛋白。标准反应体系为：总体积50μ l，5yg底物 (sumo-eGFP)，1 μ 1制备的重组ULP1激酶。
[0042] 标准切割缓冲液成分：25mM Tris-HCl, 1 % ΝΡ-40, 250mM NaCl, 50 % (V/V) Glycerol, pH = 8. 0〇
[0043] Tris-HCl 缓冲液成分：25mM Tris-HCl, pH = 8. 0。
[0044] PBS 缓冲液成分：38. 7mM Na2HP04, 11. 3mM NaH2P04, 150mM NaCl, pH = 7. 4。
【权利要求】
1. 一种重组ULP1激酶的编码序列，其特征在于，所述编码序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -种质粒，其特征在于，所述质粒含有SEQ ID NO. 1所示的编码序列。
3. 如权利要求2所述的质粒，其特征在于，所述质粒为pCD-ULPl，其全序列如SEQ ID NO. 2所示。
4. 一种权利要求1所示序列的编码蛋白，其特征在于，所述蛋白序列如SEQ ID NO. 3所 /_J、1 ο
5. -种重组ULP1激酶的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1)将SEQ ID NO. 1所示的序列通过酶切方式接入表达载体pCold-II，得到质粒 pCD-ULPl ;(2)将质粒pCD-ULPl转入大肠杆菌，37°C倒置培养过夜； (3) 挑取单菌落至505培养基，于37°C条件下进行种子培养7 - 9h ; (4) 将种子培养基接入5052培养基，接种量为0. 08 -1. 2%，于16 - 37°C诱导培养 16 - 72h后离心收集菌体； (5) 将收集的菌体超声破碎后过镍柱纯化：首先过PBS平衡镍柱，然后用咪唑洗脱重组 的ULP1激酶，再将洗脱出的重组ULP1激酶脱盐并收集保存。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2)所述大肠杆菌为大肠杆菌 BL21(DE3) 〇
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（4)所述离心条件是4°C、5000rpm、离 心 30min。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（5)是将收集的菌体用PBS悬浮， 然后将悬浮的菌体在功率30%、开5s停12s条件下超声破碎30min，再将破碎后的菌体于 4?、15000rpm条件下离心30min后过镍柱纯化。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述咪唑洗脱是用50mM咪唑和200mM咪唑 各洗脱一次后再用400mM咪唑洗脱；然后将洗脱液加入超滤管中，于4°C、5000rpm条件下离 心30min进行脱盐。
【文档编号】C12N9/12GK104099354SQ201410331141
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月11日 优先权日:2014年7月11日
【发明者】孟尔, 张东裔, 吴慧, 鲍邵衡, 李文颖, 吴磊, 朱凌云, 柳珑, 王干 申请人:中国人民解放军国防科学技术大学