一种能靶向抑制erk信号通路的抗肿瘤多肽及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学及生物医药技术领域，具体地说，涉及一种能靶向抑制ERK 信号通路的抗肿瘤多肽及其应用。
【背景技术】
[0002] 磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)是目前发现的最为重要的促进细胞生 长以及肿瘤发生、发展的信号通路之一，因此，很多临床前或临床中正在使用的药物，包括 化疗药、靶向治疗药物等都被设计或者被证明通过抑制AKT信号途径从而达到抗肿瘤的效 果。
[0003] 但人们发现，这类药物在经过初期较好的抗肿瘤效应后，往往会产生药物耐受而 失效。我们的研宄发现，使用PI3K/AKT的抑制剂，如MK2206、NVP-BEZ235处理前列腺癌细 胞后，虽然能显著抑制AKT的激活，但却会导致细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular regulatedproteinkinases，ERK)信号通路的激活，两者之间存在负反馈调节平衡，见图 1。除此之外，该种负反馈调节平衡还存在于乳腺癌、结肠癌、直肠癌等其他类型肿瘤中。
[0004]ERK是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)的最重 要的亚家族成员，而MAPK也是目前已知的重要的促细胞生长、促肿瘤信号通路。这提示我 们，ERK被负反馈激活是PI3K/AKT抑制剂出现耐药的重要分子生物学机制。
[0005] 然而，目前AKT与ERK信号途径之间的负反馈调节机制仍不清楚，也未见使用 PI3K/AKT抑制剂抗肿瘤治疗的同时通过抑制ERK信号通路来提高药物治疗效果的相关报 道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种能靶向抑制ERK信号通路的抗肿瘤多肽。
[0007] 本发明提供了一种多肽，所述的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] 本发明提供了一种分离的核酸分子，它编码序列如SEQ ID NO. 2所不的多肽。
[0009] 作为本发明的一个优选例，所述的核酸分子的序列如SEQIDNO. 3所不。
[0010] 本发明提供了一种表达载体，所述的表达载体包含有如上所述的核酸分子。
[0011] 本发明提供了一种药物组合物，它含有序列如SEQIDNO. 2所示的多肽，和药学上 可接受的载体。
[0012] 作为本发明的一个优选例，所述的药物组合物还包含PI3K/AKT抑制剂或紫杉醇 类药物。
[0013] 本发明提供了所述的多肽、所述的核酸分子、所述的表达载体或所述的药物组合 物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0014] 作为本发明的一个优选例，所述的肿瘤中AKT与ERK信号途径之间存在负反馈调 -K-
[0015] 更优选地，所述的肿瘤为前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、食管癌、鼻咽 癌、肺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌或胰腺癌。
[0016] 本发明还提供了所述的多肽、所述的核酸分子、所述的表达载体或所述的药物组 合物在制备药物中的应用，所述的药物用于克服PI3K/AKT抑制剂或紫杉醇类药物在抗肿 瘤治疗过程中出现的耐药。
[0017] 本发明优点在于：本发明构建了一个靶向抑制ERK信号通路的小分子多肽P2SE， 通过一系列生物学实验证明P2SE在多种肿瘤（前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌）中均能 有效克服PI3K/AKT抑制剂或紫杉醇类药物在抗肿瘤治疗过程中出现的耐药，有显著的协 同抗肿瘤作用。由于ERK信号通路存在于多种肿瘤中，是促进细胞生长以及肿瘤发生、发展 的重要信号通路之一，因此小分子多肽P2SE可用于此类肿瘤的治疗，优选与PI3K/AKT抑制 剂或紫杉醇类药物联合使用。
【附图说明】
[0018] 图I.LNCaP、C4-2、C4-2B为三种前列腺癌细胞。MK2206 :0? 5yM，NVP-BEZ23550nM， 处理24小时后收集细胞提取蛋白，westernblot检测。显示MK2206、NVP-BEZ235处理前 列腺癌细胞后，虽然能显著抑制AKT的激活，但却会导致ERK信号通路的激活。
[0019] 图2.能与支架蛋白IQGAPl的CC结构域结合的FOXOl片段的氨基酸序列的鉴定。
[0020] 图 3.pCMV-HA载体图谱。
[0021] 图4.CHX10yg/ml，预处理30min，MK22060. 5yM，处理6小时后收集细胞提取蛋 白，westernblot检测。
[0022] 图5.MK22060. 5yM，持续处理48小时，MTS检测吸光度。
[0023] 图6.MK22060. 5yM，处理6小时后收集细胞提取蛋白，westernblot检测。
[0024] 图7?左图：PTX10nM，处理24小时，收集细胞提取蛋白，westernblot检测。右 图：LNCaP细胞，DTX10nM，处理24小时，收集细胞提取蛋白，westernblot检测。
[0025] 图8?左图：PC3细胞，DTX 10nM，处理24小时，收集细胞提取蛋白，western blot 检测。右图：免疫荧光检测，表明PC3稳定株中P2SE多肽稳定表达。绿色荧光：HA;蓝色荧 光：DAPI〇
[0026] 图9.左图：Xen〇gen活体成像系统动态观察肿瘤荧光强度。右图：DTX处理24天 后处死，各组肿瘤大小情况。
[0027] 图10.各组小鼠在0天和24天时肿瘤荧光强度对比。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0029] 本发明的发明人通过研宄发现叉头转录因子I (FOXOl)掌控、平衡肿瘤细胞中AKT 与ERK信号途径之间的负反馈调节：当AKT激活时，F0X01被AKT磷酸化，并被转移至细胞浆 中，细胞浆中的F0X01与支架蛋白IQGAPl的CC结构域结合从而抑制了ERK的激活；反之， 当AKT被抑制，F0X01从细胞浆转移至细胞核内，解除了与CC结构域的结合，从而ERK信号 通路被激活。提示在使用PI3K/AKT抑制剂或紫杉醇类药物抗肿瘤治疗的同时抑制ERK信 号通路，将是克服耐药、提高该类药物治疗效果的关键。因此，发明人设计了一个能与支架 蛋白IQGAPl的CC结构域特异性结合的多肽，在细胞及动物体内表达该多肽，进行了一系列 生物学实验，验证了该多肽具备显著的抗肿瘤效果。
[0030] 实施例1构建pCMV-P2SE质粒
[0031] 参见图2,利用GST-PULL技术鉴定了能与支架蛋白IQGAPl的CC结构域结合的 载体（购于Clontech公司，载体图谱见图3)构建表达该序列的质粒，并将第319位点上的 丝氨酸（S)点突变为谷氨酸（E)，达到模拟磷酸化状态的目的，g卩：NDDFDNWSTFRPRTSENAST ISGRLSPMT(SEQIDNO. 2)。我们将构建的质粒命名为pCMV-P2SE，所表达的多肽（序列如 SEQIDNO. 2所示）命名为P2SE。
[0032] pCMV-P2SE质粒的构建方法为：用EcoRI和XhoI酶酶切pCMV-HA载体，与P2SE 的表达序列（CTATTATTAAAATTACTAACCTCATGAAAAGCAGGAGCATGATCACTTCTACGATCATGATAATC ACCAGCAAAITCAGGATAATACTGA，SEQIDNO. 3)进行连接得到pCMV-P2SE质粒，测序验证正确。
[0033] 实施例2 P2SE在前列腺癌细胞中抑制了MK2206引起的ERK信号途径的激活
[0034] 在前列腺癌细胞LNCaP中转染pCMV-P2SE质粒，细胞体内表达P2SE多肽。结果发 现：MK2206处理的LNCaP细胞p-AKT受抑制，p-ERK显著升高；而在转染表达P2SE多肽的 细胞，P-AKT受抑制的同时，p-ERK并没有出现激活。同时用CHX处理细胞，以排除P2SE的 核转录功能引起的上述作用。见图4。
[0035] 实施例3 P2SE反转了前列腺癌细胞对MK2206的耐受
[0036] 在前列腺癌细胞LNCaP中转染pCMV-P2SE质粒，细胞体内表达P2SE多肽，进行MTS 实验，检测LNCaP细胞的增殖活性。结果如图5所示，单独用MK2206处理的细胞，在经历一 个短暂的细胞抑制后，重新出现细胞增殖的反弹；而在表达P2SE的细胞中，MK2206处理后， 细胞增殖持续受到抑制。
[0037] 实施例4 P2SE在乳腺癌细胞中抑制了MK2206引起的ERK信号途径的激活
[0038] 我们在两种乳腺癌细胞MDA-MB-468及BT-474中重复了上述前列腺癌细胞中的实 验。结果与前列腺癌细胞实验类似，如图6所示。MK2206处理的乳腺癌细胞p-AKT受抑制， P-ERK显著升高；而在转染表达P2SE多肽的细胞，p-AKT受抑制的同时，p-ERK并没有出现 激活。
[0039] 实施例5P2SE抑制了紫杉醇类化疗药物引起的前列腺癌、乳腺癌细胞ERK信号途 径的激活
[0040] 紫杉醇类药物是治疗前列腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤化疗药物，但治疗效果 较差，原因是病人对多稀紫杉醇耐药或病人无法耐受化疗毒性。我们在前列腺癌细胞 LNCaP及乳腺癌细胞BT-474中转染pCMV-P2SE质粒，细胞体内表达P2SE多肽，并用紫杉醇 (Paclitaxel，PTX)或多稀紫杉醇（Docetaxel，DTX)治疗，结果发现，PTX或DTX处理的肿 瘤细胞P-AKT受抑制，p-ERK显著升高；而在转染表达P2SE多肽的细胞，p-AKT受抑制的同 时，P-ERK并没有出现激活。见图7。
[0041] 实施例6稳定表达P2SE的前列腺癌细胞中，DTX引起的ERK信号途径激活被抑制
[0042] pTsin-P2SE质粒的构建：以pCMV-P2SE模板