Wnt信号通路抑制剂的新用图
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，涉及Wnt信号通路抑制剂的新用途，特别涉及Wnt信号通路抑制剂一XAV939在治疗常染色体显性遗传性多囊肾中的应用。
【背景技术】
[0002]XAV939是小分子选择性抑制剂，可以抑制Wnt通路转录因子β -catenin调节的转录。XAV939通过抑制端锚聚合酶1、2 (Tankyrase 1 and Tankyrase 2),使二者不能与Axin高保守区相互作用，进而阻止了 Axin被泛素途径降解。由于XAV939能够稳定β-catenin降解复合体中的组成成分Axin,延长其半衰期,使Axin的浓度上升,从而促使细胞内的β -catenin降解加速,进而抑制经典Wnt通路的活性。XAV939作用于端锚聚合酶1和端锚聚合酶1时IC50分别为llnM和4nM。
[0003]目前，该药已用于临床I期实验。
[0004]常染色体显性遗传性多囊肾(AutosomalDominant Polycystic Kidney Disease,ADPKD)疾病是最常见的单基因遗传性肾病之一。其主要临床症状为双侧肾脏形成大量大小不等的球形液性囊肿，并进行性增大，破坏肾脏的结构和功能，最终导致肾功能衰竭。ADPKD通常在成人中发病，其发病率为1:400-1000，是目前世界上终末肾衰竭的第三大病因。除肾病表型外，ADPKD患者的非肾脏部位病变表型也十分明显:83%的ADPKD患者出现肝囊肿，16%的患者出现脑动脉瘤。其他病理表型包括主动脉根，胸部动脉异常，二尖瓣脱垂以及腹壁疝气。约50%的患者年满60岁后将出现终末肾衰竭。正常人的尿素氮(BUN)参考范围为2.14-7.14mmol/L，血肌酐(CRE)参考范围为44-133 μ mol/L，当血肌酐超过133ymol/L为炎症损伤期，超过186 μ mol/L为肾功能损伤期，超过451umol/L为肾功能衰竭期。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供Wnt信号通路抑制剂的新用途。
[0006]本发明所提供的Wnt信号通路抑制剂的新用途，可为Wnt信号通路抑制剂在制备治疗常染色体显性遗传性多囊肾(ADPKD)的产品中的应用。
[0007]进一步，Wnt信号通路抑制剂在制备如下任一产品中的应用也属于本发明的保护范围:
[0008](1)减弱患病机体肾囊肿程度的产品；
[0009](2)降低患病机体肾脏体重比的产品；
[0010](3)降低患病机体的肾脏囊肿指数的产品；
[0011](4)降低患病机体血液中肌酐和/或尿素氮含量的产品。
[0012]在本发明中，所述Wnt信号通路抑制剂具体为XAV939(化学式:C14HnF3N20S)。
[0013]所述患病机体为具有常染色体显性遗传性多囊肾(ADPKD)临床症状的机体，如常染色体显性遗传性多囊肾(ADPKD)患者。在本发明中，以Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠作为ADPKD动物模型，即为具有常染色体显性遗传性多囊肾(ADPKD)临床症状的机体，上述(1)则具体表现为减弱Vil-Cre:Pkd2f3/f~j、鼠的肾囊肿程度；上述(2)则具体表现为降低Vil-Cre:Pkd2f3/fM、鼠的肾脏体重比；上述(3)则具体表现为降低Vil-Cre:Pkd2f3/fM、鼠的肾脏囊肿指数；上述(4)则具体表现为降低Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠血液中的肌酐和/或尿素氮含量。
[0014]本发明的再一个目的是提供一种产品。
[0015]本发明所提供的产品的活性成分为Wnt信号通路抑制剂，该产品具有如下用途中的至少一种:
[0016](a)治疗常染色体显性遗传性多囊肾；
[0017](b)减弱患病机体肾囊肿程度；
[0018](c)降低患病机体肾脏体重比；
[0019](d)降低患病机体的肾脏囊肿指数；
[0020](e)降低患病机体血液中肌酐和/或尿素氮含量。
[0021]在本发明中，所述Wnt信号通路抑制剂具体为XAV939(化学式:C14HnF3N20S)。
[0022]所述患病机体为具有常染色体显性遗传性多囊肾(ADPKD)临床症状的机体，如常染色体显性遗传性多囊肾(ADPKD)患者。在本发明中，以Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠作为ADPKD动物模型，即为具有常染色体显性遗传性多囊肾(ADPKD)临床症状的机体，上述(b)则具体表现为减弱Vil-Cre:Pkd2f3/f~j、鼠的肾囊肿程度；上述(c)则具体表现为降低Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠的肾脏体重比；上述⑷则具体表现为降低Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠的肾脏囊肿指数；上述(e)则具体表现为降低Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠血液中的肌酐和/或尿素氮含量。
[0023]在以上所述的各应用或产品中，所述产品具体可为药物。
[0024]以上所有的所述Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠均按照包括如下步骤的方法构建得到:
[0025](I)将 Pkd2f3/f3 小鼠(记载于 “lngyu Kim, Tianbing Ding, Yulong Fu, etal.Condit1nal Mutat1n of Pkd2 Causes Cystogenesis and Upregulates β -Catenin.J Am Soc Nephrol，2009 (20): 2556-2569”一文)与带有 Vil-Cre 重组酶的转基因小鼠(购自 The Jackson Laboratory,Strain Name:B6.SJL-Tg (Vil~cre)997Gum/J,Stock Number:004586，详见网址:http: //jaxmice.jax.0rg/strain/004586, html)进行杂交，得到 FI 代(其中理论上有1/2后代的基因型为Vil-Cre:Pkd2+/f3 ；1/2后代的基因型为Pkd2+/f3)；
[0026](II)将步骤⑴得到的F1代(Vil-Cre:Pkd2+/f3)与所述Pkd2f3/f3小鼠进行回交，得到回交后代；
[0027](III)从步骤(II)得到的回交后代中筛选出Pkd2基因纯合，同时表达Vil-Cre的小鼠，即为 Vil-Cre:Pkd2f3/f3 小鼠。
[0028]其中，步骤(III)中所述“从步骤(II)得到的回交后代中筛选出Pkd2基因纯合，同时表达Vil-Cre的小鼠”，可按照如下方法实现:以所述回交后代的小鼠基因组为模板，采用针对 Pkd2 基因的引物(三条:5，-TCT GAC TTG CAG ACT GTG GG_3，，5，-AGG TAG GGGAAG GTC AGG GTT GG-3’，5’ -TTTACGTCCAGCCAAGCT-3’)和针对 Cre 基因的引物(两条:5，-CCA GGT TAC GGA TAT AGT TCA TG_3，，5，-TGC CAC GAC CAA GTG ACA GC-3，)分别进行PCR扩增；针对？1?12基因进行PCR扩增得到大小为650bp的单一条带(Pkd2基因纯合)，同时针对Cre基因进行PCR扩增得到大小为650bp的条带(表达Vil-Cre)的小鼠即为所述 Vil-Cre:Pkd2f3/f3 小鼠。
[0029]本发明以Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠作为ADPKD动物模型，进行了 Wnt信号通路抑制剂一XAV939对常染色体显性遗传性多囊肾(ADPKD)治疗的效果研究，结果表明，Wnt信号通路抑制剂一XAV939对于治疗常染色体显性遗传性多囊肾具有一定的效果，具体体现在:
(1)可减弱Vil-Cre:Pkd2f3/fM、鼠的肾囊肿程度；(2)可降低Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠的肾脏体重比；(3)可降低Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠的血液中肌酐和/或尿素氮的含量。本发明对于常染色体显性遗传性多囊肾(ADPKD)发病机制的分析，对于治疗常染色体显性遗传性多囊肾(ADPKD)的药物的研发均具有重要意义。
【附图说明】
[0030]图1为回交后代小鼠基因型的PCR检测结果。其中，A为针对Pkd2基因PCR检测结果，Pkd2f3/f3为Pkd2基因纯合，Pkd2+/f3为Pkd2基因杂合；B为针对Cre基因的PCR检测结果，Vil-cre为表达Vil-Cre ；WT为不表达Vil-Cre。
[0031]图2为Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠模拟人类ADPKD的疾病表型。其中，A为Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠肾脏形态；B为Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠肝脏形态；C为Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠胰腺形态；D为Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠的肾脏横切面；E为Pkd2f3/f3小鼠的肾脏横切面。
[0032]图3为两组小鼠的肾脏HE染色结果。其中，A表示治疗组；B表示对照组。A和B中，1、2、3、4均表示两组不同个体小鼠的肾脏HE染色结果。
[0033]图4为两组小鼠的肾脏体重比测定结果。
[0034]图5为两组小鼠的肾脏囊肿指数测定结果。
[0035]图6为两组小鼠的血液中尿素氮(BUN)与肌酐(CRE)的含量测定结果。其中，A表示肌酐含量表示尿素氮含量。
【具体实施方式】
[0036]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0037]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038]Pkd2f3/f3 小鼠:记载于“lngyu Kim, Tianbing Ding, Yulong Fu, etal.Condit1nal Mutat1n of Pkd2 Causes Cystogenesis and Upregulates β -Catenin.J Am Soc Nephrol，2009(20): 2556-2569” 一文中。其构建及鉴定过程大体如下:首先，在Pkd2基因的3号外显子两侧插入两个ΙοχΡ位点，在阳性选择性Neo的两侧有FRT位点，由于该结构没有完全阻断正常Pkd2基因的表达，所以用这种载体通过基因打靶技术产生的Pkd2nf3小鼠可避免死于胚胎期。再将Pkd2nf3小鼠与ACTB-F1印小鼠杂交，即产生没有Neo元件的Pkd2f3/f3小鼠。鉴于在Pkd2f3/f3小鼠中没有观察到多囊表型，PC2的表达也没有发生改变，认为这种Pkd2f3等位基因不会导致Pkd2的表达失活。
[0039]带有Vil-Cre 重组酶的转基因小鼠:购自 The Jackson Laboratory, Strain Name:B6.SJL-Tg(Vi 1-cre)997Gum/J, Stock Number:004586,详见网址:http://jaxmice.jax.0rg/strain/004586, html。
[0040]XAV939:Selleck 公司，产品目录号 S1180。分子量:312.31 ;化学式:C14HnF3N20S ；CAS 号:284028-89-3 ;溶解性(25。。):DMSO 12mg/mL，水〈lmg/mL，乙醇〈lmg/mL ;稳定性:3年-20°C粉状，6月-80°C溶于DMSO。
[0041]实施例l、Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠模型的构建及鉴定
[0042]Vi