Shh信号通路特异性抑制剂的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域；更具体地，本发明涉及SHH信号通路特异性抑制剂的应用。
【背景技术】
[0002]癫痫(epilepsy)，是大脑神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病。世界范围内，约有I %人口患有癫痫。在中国癫痫已经成为神经科仅次于头痛的第二大常见病。癫痫的病因十分复杂，包括遗传因素，大脑发育异常，脑损伤等等。总体来说，癫痫的发病起因是由于神经网络抑制性和兴奋性失衡，而导致的兴奋型神经递质谷氨酸的大量堆积。癫痫的治疗方法主要是药物治疗和手术切除病灶。目前约有30%的颞叶癫痫患者对现有的抗癫痫药物不敏感或是产生耐药。而手术切除不但高风险高复发率，且可能导致大脑功能损伤(Morimoto K等(2004)Kindling and status epilepticus modelsof epilepsy: rewiring the brain.Progress in neurob1logy 73(1):1_60)。因此，发现诱导癫痫的新靶点及新药物对抗癫痫的治疗具有重要的意义。
[0003]Sonic Hedgehog(SHH)是一种分泌蛋白，它既是形态发生素又是促分裂素，在中枢神经系统发育中起着至关重要的作用(Jiang J&Hui CC(2008)Hedgehog signaling indevelopment and cancer.Developmental cell 15(6):801-812)。
[0004]然而，虽然SHH信号通路在成年动物的大脑中依然有着广泛的表达，但其作用却不完全清楚。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供SHH信号通路特异性抑制剂在改善或治疗癫痫方面的应用。
[0006]在本发明的第一方面，提供一种SHH信号通路抑制剂的用途，用于制备改善或治疗癫痫的组合物。
[0007]在一个优选例中，所述改善或治疗癫痫包括:
[0008]延缓癫痫发生；
[0009]抑制海马神经元癫痫样放电；和/或
[0010]降低癫痫发作强度。
[0011]在另一优选例中，所述的SHH信号通路抑制剂包括:环巴胺(Cyclopamine)，⑶C-0449，或它们的类似物。
[0012]在本发明的另一方面，提供SHH信号通路的用途，用于筛选改善或治疗癫痫的潜在物质；较佳地，所述筛选不包括疾病诊断或治疗方法相关的方法。
[0013]在本发明的另一方面，提供一种筛选改善或治疗癫痫的潜在物质的方法，所述方法包括:
[0014](I)用候选物质处理包含SHH信号通路的体系；
[0015](2)检测所述体系中SHH蛋白的表达量、活性或分泌量，或检测SHH信号通路下游分子的磷酸化水平或SHH信号通路下游转录因子的表达量；
[0016]其中，若所述候选物质可降低SHH蛋白的表达量、活性或分泌量，或降低SHH信号通路下游分子的磷酸化水平或SHH信号通路下游转录因子的表达量，则表明该候选物质是改善或治疗癫痫的潜在物质。
[0017]在一个优选例中，步骤(I)包括:在测试组中，将候选物质加入到包含SHH信号通路的体系中；和/或
[0018]步骤(2)包括:检测测试组的体系中SHH蛋白的表达量、活性或分泌量，或检测SHH信号通路下游分子的磷酸化水平或SHH信号通路下游转录因子的表达量，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的包含SHH信号通路的体系；
[0019]如果测试组中SHH蛋白的表达量、活性或分泌量在统计学上低于(优选显著低于，如低20%以上，较佳的低50%以上；更佳的低80%以上)对照组，或SHH信号通路下游分子的磷酸化水平或SHH信号通路下游转录因子的表达量在统计学上低于(优选显著低于，如低20%以上，较佳的低50%以上；更佳的低80%以上)对照组，就表明该候选物是改善或治疗癫痫的潜在物质。
[0020]在另一优选例中，所述的体系选自:细胞体系(如内源存在SHH信号通路的海马神经元或其细胞培养物)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
[0021]在另一优选例中，所述的体系是细胞体系。
[0022]在另一优选例中，所述的体系是内源存在SHH信号通路的海马神经元或其细胞培养物。
[0023]在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于):针对所述存在SHH信号通路(含该通路的基因或蛋白)设计的小分子化合物，针对SHH信号通路或其上游或下游蛋白设计的干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体)、小分子化合物等。
[0024]在另一优选例中，所述的方法还包括:对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于改善或治疗癫痫有用的物质。
[0025]在本发明的另一方面，提供一种用于改善或治疗癫痫的组合物，所述的组合物含有:
[0026](I)环巴胺(Cyclopamine)，⑶C-0449，或它们的类似物；和
[0027](2)药学上可接受的载体。
[0028]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【附图说明】
[0029]图1、SHH通过抑制谷氨酸转运体增加胞外谷氨酸水平。
[0030](A-C)，用高效液相色谱的方法检测胞外谷氨酸水平的变化。检测在给予空白对照，SHH, Cyclopamine (Cyclo)或是SHH和Cyclo刺激后，海马神经元培养液中谷氨酸水平的变化。数据从三组以上独立的实验收集，用平均值土标准误表示。*p〈0.05 ;**p〈0.01 ；***p〈0.001相对于对照组。(D-F)，3H谷氨酸摄取实验，检测给与空白对照，SHH, Cyclo或是SHH和Cyclo刺激后，培养的海马神经元谷氨酸摄取能力的变化。数据从三组以上独立的实验收集，用平均值土标准误表示。***p〈0.0Ol相对于对照组。
[0031 ] 图2、癫痫性刺激促进SHH的分泌。
[0032]在模拟癫痫刺激的条件下检测原代培养的海马神经元SHH的分泌水平。A，分别给予正常外液和无Mg2+外液(OMg 2+)孵育海马神经元15分钟，30分钟或60分钟后，用ELISA的方法检测细胞外液中SHH的分泌量。B，分别给予正常外液和含有100 μΜ PTX,6.5mMKCl (K+)的外液孵育海马神经元15分钟，30分钟或60分钟后，用ELISA的方法检测细胞外液中SHH的分泌量。数据从三组以上独立的实验收集，用平均值土标准误表示。*p〈0.05 ;**p〈0.01相对于对照组。
[0033]图3，Cyclopamine和⑶C-0449抑制神经元癫痫样放电频率。
[0034]用全细胞记录的方法，在原代培养的海马神经元上记录给与刺激后神经元癫痫样放电的情况。A，用正常外液或无Mg2+外液孵育，在存在Cyclo (浓度10 μΜ)或是vehicle的条件下，记录神经元癫痫样放电，统计放电频率。B，用正常外液或PTX，6.5mM KCl外液孵育，在存在Cyclo(浓度10 μΜ)或是vehicle的条件下，记录神经元癫痫样放电，统计放电频率。数据从三组以上独立的实验收集，用平均值土标准误表示。**p〈0.01 ;*#p〈0.001相对于对照组。C，PTX, 6.5mM KCl外液孵育，在存在GDC-0449 (浓度10 μ M)或是vehicle的条件下，神经元癫痫样放电示例图。
[0035]图4，Cyclopamine抑制海马脑片中神经元癫痫样