一种水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌、巴氏杆菌三联灭活疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开一种水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌、多杀巴氏杆菌三联灭活疫苗及制备 方法。可用于预防水貂的绿脓杆菌病、克雷伯氏菌病和多杀巴氏杆菌病以及三者的混合感 染，涉及经济动物疫苗生产技术领域。
【背景技术】
[0002] 水貂绿脓杆菌病，其病原体为铜绿假单胞菌，由于侵入机体后可产生绿色脓汁，故 而习惯上称之为绿脓杆菌。绿脓杆菌为一种条件致病菌，存在于正常健康动物的机体内， 当机体受到应激或免疫功能下降时，它才有机会感染机体。绿脓杆菌为革兰氏阴性杆菌或 球菌，对营养要求不高，在普通培养基中即可生长。由于在生长过程中能产生绿脓素和荧光 素，所以培养基上会被染成蓝绿色。绿脓杆菌可引起水貂的出血性肺炎，此病多发生于秋 季，主要以发病急，死亡快，呈暴发性流行为特点。1983年，此病首次在我国被报导，死亡率 达到24. 1%，第二年，山东一家水貂养殖场暴发了水貂出血性肺炎，200多只水貂死亡了 67 只，死亡率达到了 31%以上。此后，2000-2013年，山东、吉林、辽宁、河北、内蒙古等各省的 大型水貂养殖场都相继发生了水貂出血性肺炎，严重影响着我国水貂养殖业的发展。此外， 绿脓杆菌对外界环境的适应性极强，能在各种复杂的环境中生存。它有着很强的耐药性，所 以，一旦感染此菌再去治疗，达不到很好的效果。因此，利用疫苗接种来预防疾病显得尤为 重要。
[0003] 水貂克雷伯氏菌是一种革兰氏阴性杆菌，为典型的条件致病菌。该菌普遍存在自 然界中，如水、土壤、空气以及饲喂的食物中，另外在动物的呼吸道和肠道内也较常见。但只 有当机体免疫力下降时，才能引发此病的大规模流行。由于水貂在运输过程中或突然改变 环境而受到应激，抵抗力下降，此时，体内的克雷伯氏菌开始大量繁殖，一旦形成感染很难 控制，死亡率达到50%以上。因此，此病在水貂养殖业中越来越受到重视。
[0004] 多杀巴氏杆菌是一种两端钝圆的短杆菌，为革兰氏阴性的需氧兼厌氧菌。对营养 要求较严格，在普通培养基上生长贫瘠，需加有血液或血清的培养基中才能生长良好。多杀 巴氏杆菌为一种可引起畜禽共患的急性、烈性传染病。多数患病的水貂会呈现暴死现象，该 病的发病率达60%以上，死亡率达90%。而慢性型的也多表现为体温升高，精神沉郁，食欲下 降，呼吸困难等症状。此病多数为急性发作，给水貂养殖业带来极大的损失。
[0005] 近年来，中国的养殖业，尤其是经济动物养殖业在迅猛发展，但与此同时，在管理 水平上并没有得到相应的提高，在预防疾病方面，不能及时有效地利用疫苗来控制疾病，一 旦发生疫病，一定程度上会给业主带来极大的经济损失。近几年，革兰氏阳性菌的感染越来 越少，而革兰氏阴性菌的感染却日益增加，特别是一些条件致病菌和引起急性死亡的细菌 再度出现。水貂的绿脓杆菌、克雷伯氏菌及多杀巴氏杆菌均可引起水貂的出血性疾病，绿脓 杆菌和克雷伯氏菌均为重要的条件致病菌，而多杀性多杀巴氏杆菌更是引起急性败血症的 致病菌。通过相应的疫苗可预防疾病的发生，但随着水貂养殖业的发展，水貂的疾病的发生 主要以二重感染和多重感染为主。所以，在一定程度上，单价疫苗不能够达到很好的预防多 种疾病的较果，同时，多种单价的使用往往存在多种禁忌，也增加了感染机率。
【发明内容】
[0006] 本发明公开了一种水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌、多杀巴氏杆菌三联灭活疫苗，从根 本上解决了多种单价疫苗在使用时往往存在多种禁忌，不仅可预防三种疾病的混合感染， 同时，也提高了对其单一疾病的免疫保护率。
[0007] 本发明所述的一种水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌、多杀巴氏杆菌三联灭活疫苗，其特 征在于： 该疫苗由抗原和常规疫苗佐剂组成，所述抗原包括水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌和多杀 巴氏杆菌，其中，多杀巴氏杆菌的保藏号为：CGMCC No: 10334 ;保藏时间：2015年01月09 日；保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，分类命名为多杀巴氏杆菌
[0008] 本发明公开了一种水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌及多杀巴氏杆菌三联灭活疫苗及其 制备方法，其特征在于： 所述疫苗中水貂绿脓杆菌灭活前的细菌浓度不少于30亿CFU/mL ;克雷伯氏菌灭活前 的细菌浓度不少于20亿CFU/mL ;多杀巴氏杆菌灭活前的细菌浓度不少于30亿CFU/mL。
[0009] 本发明所述的水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌和多杀巴氏杆菌三联灭活疫苗的制备方 法，其特征在于，包括以下步骤： 1、 将水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌和多杀巴氏杆菌菌株分别培养繁殖其生产用种子，并 进行纯粹检验； 2、 将上述用于生产的水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌和多杀巴氏杆菌种子液分别接种到生 物反应器培养基中进行发酵增殖培养，同时，对该产物进行纯粹检验及活菌计数； 3、 将增殖培养后的三种菌株进行灭活，制得灭活抗原液，并对该产物进行灭活检验和 无菌检验； 4、 将灭活后且检验合格的灭活抗原液离心处理，15000rpm -20000rpm连续离心，弃去 上清收集菌泥，并对菌泥按一定比例进行稀释，置2-8°C条件下保存； 5、 将用于生产的水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌和多杀巴氏杆菌三种灭活且处理后的三种 等量抗原与佐剂混合，制备水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌、多杀巴氏杆菌三联灭活疫苗，并进 行物理性状检验、无菌检验、安全检验、效力检验和甲醛硫柳汞残余量检验； 6、 水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌、多杀巴氏杆菌三联灭活疫苗分装、贮存。
[0010] 本发明的积极效果在于： 三种疫苗联合具有协同增效作用，达到了一针多防目的，更全面地预防水貂细菌疾病， 同时提高了绿脓杆菌、克雷伯氏菌、多杀巴氏杆菌任何一种单一疾病的免疫保护率，从根本 上解决了多种单价疫苗在使用时往往存在多种禁忌，不仅可预防三种疾病的混合感染，同 时，也提高了对其单一疾病的免疫保护率。
【具体实施方式】
[0011] 通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离 本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改 动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
[0012] 实施例1 水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌、多杀巴氏杆菌三联灭活疫苗的制备 1.生产用种子制备 (1) 一级种子制备 将多杀巴氏杆菌基础菌种接种于含0. 1%裂解血球全血及4%健康动物血清的马丁琼 脂平板上，置36- 37°C培养24小时，然后选5个以上典型菌落，接种鲜血琼脂斜面若干支， 36- 37°C培养24小时，作为一级种子，于2-8°C保存，使用期应不超过14日。传代不得超 过5代。
[0013] 将绿脓杆菌和克雷伯氏菌基础菌种接种于普通肉汤培养基琼脂平板上，置36- 37°C培养24小时，然后选5个以上典型菌落，接种普通琼脂斜面若干支，36- 37°C培养24 小时，作为一级种子，于2- 8°C保存，使用期应不超过14日。传代不得超过5代。
[0014] (2)二级种子制备 取多杀巴氏杆菌一