一种炎症诱导蛋白组分、其制备方法及产品的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及一种炎症诱导蛋白组分、其制备方法及 广品。
【背景技术】
[0002] 促炎物质，是一类可介导多种免疫反应。近期研宄发现，促炎可介导肿瘤细胞坏 死，是有前景的抗肿瘤物质。
[0003]目前市场上常用的促炎物质，脂多糖LPS促炎效果强烈，用量不易准确控制，副作 用强烈。因此继续开发新型的促炎物质，如炎症诱导蛋白等。
【发明内容】
[0004] 针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种炎症诱导蛋白组分、其 制备方法及产品，其目的在于提供一种促炎效果稳定可控副作用小的促炎蛋白，由此解决 目前脂多糖促炎物质促炎效果强烈，用量不宜准确控制，副作用大的技术问题。
[0005] 为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种炎症蛋白组分为荔枝 蛋白提取物，经鸟枪法质谱分析包括蛋白，检测得到的肽段覆盖率在10%以上的蛋白 质包括：40?核糖基化因子1(40?-1'；113〇87131:;[011€301:01'1)、3-磷酸甘油醛脱氢酶6八 PCl (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPCl)、Actin_7、14-3-3 样蛋白 GF14A (14-3-3-like protein GF141ambda)、泛素-40S核糖体蛋白 S27a-l(Ubiquitin_40S ribosomal protein S27a_l)、14-3-3 样蛋白 GF14? (14_3-3_like protein GF14omega)、 14-3-3 样蛋白 GF14 u (14-3-3-like protein GFMupsilon)、^调蛋白 I(Calmodulin-I)、真核起始因子 4A-1 (Eukaryotic initiation factor 4A-1)0
[0006] 按照本发明的另一方面，提供了一种所述炎症诱导蛋白组分的制备方法，包括以 下步骤：
[0007] (1)将新鲜荔枝去皮、除核并榨碎制得匀浆，固液分离后保留上清液；
[0008] (2)将步骤（1)中制得的上清液浓缩，透析48至96小时得到粗提物，截流量在8KD 至14KD之间；
[0009] (3)对步骤（2)中制得的粗提物进行冷冻干燥，并采用酚提法提取蛋白质，经丙酮 洗涤后氮气吹干，得到所述炎症诱导蛋白组分。
[0010] 优选地，所述制备方法，其步骤⑵所述透析时间为72小时，截流量为8KDa。
[0011] 优选地，所述制备方法，其步骤（3)所述酚提法提取蛋白质的具体步骤为：
[0012] (3-1)称取粗提物冷冻干燥粉末加入预冷的酚提取缓冲液中制得混合液，添加量 在 5mg/mL 至 8mg/ml 之间；
[0013] (3-2)将步骤（3-1)中制得的混合液提纯一次或多次，提纯步骤为：加入等体积预 冷的Tris饱和酚溶液，混合均匀后震荡离心取上层酚相；
[0014] (3-3)在步骤（3-2)中提取的酚相中加入提前预冷的0? 05M至0? 15M的乙酸铵的 甲醇溶液，添加体积比在1:2至2:1之间，静置使蛋白沉淀，并分离得到蛋白质沉淀。
[0015] (3-4)将步骤（3-3)得到的蛋白质沉淀中，加入丙酮洗涤2次，氮气吹干，得到所述 炎症诱导蛋白组分。
[0016]优选地，所述制备方法，其步骤（3-1)所述的酚提取缓冲液为含有700mM蔗糖、 IOOmM氯化钾、500mM三羟甲基氨基甲烷以及63. 7mM EDTA的水溶液，其pH = 7. 5。
[0017] 按照本发明的另一个方面，提供了一种促炎制剂，其特征在于，包括所述炎症诱导 蛋白组分。
[0018] 总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于从天然温和 成分中提取炎症诱导蛋白组分，能够取得下列有益效果：
[0019] (1)本发明提供的炎症诱导蛋白组分，促炎效果明确且温和，用量容易控制，天然 物质提取无副作用。
[0020] (2)本发明提供的方法，原料易得，过程安全，适合大规模生产。
【附图说明】
[0021] 图1是实施例4中LWP蛋白组分使得C0X-2mRNA表达水平变化；
[0022] 图2是实施例4中LWP蛋白组分使得iNOS mRNA表达水平变化；
[0023] 图3是实施例4中LWP蛋白组分使得IL-I 0 mRNA表达水平变化；
[0024] 图4是实施例4中LWP蛋白组分使得HO-ImRNA表达水平变化。
【具体实施方式】
[0025] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要 彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0026] 本发明提供的炎症诱导蛋白组分，为荔枝蛋白提取物，命名为LWP，经鸟枪法质谱 分析蛋白质，检测得到的肽段覆盖率在10%以上的蛋白质包括：ADP核糖基化因子1、3_磷 酸甘油醛脱氢酶GAPC1、Actin-7、14-3-3样蛋白GF14A、泛素-40S核糖体蛋白S27a-1、 14-3-3样蛋白GF14?、14-3-3样蛋白GF14u、钙调蛋白1、真核起始因子4A-1。
[0027] 所述炎症诱导蛋白组分，其制备方法，包括以下步骤：
[0028] (1)将新鲜荔枝去皮、除核并榨碎制得匀衆，固液分离后保留上清液。
[0029] (2)将步骤（1)中制得的上清液浓缩，透析48至96小时得到粗提物，截流量在8KD 至14KD之间；优选地，透析时间为72小时，截流量为8KDa。
[0030] (3)对步骤（2)中制得的粗提物进行冷冻干燥，并采用酚提法提取蛋白质，经丙 酮沉淀后氮气吹干，得到所述炎症诱导蛋白组分。
[0031] 酚提法提取蛋白质的具体步骤为：
[0032] (3-1)称取步骤（2)制得的粗提物冷冻干燥粉末加入预冷的酚提取缓冲液中制得 混合液，添加量在5mg/mL至8mg/ml之间；
[0033] (3-2)将步骤（3-1)中制得的混合液提纯一次或多次，提纯步骤为：加入等体积预 冷的Tris饱和酚溶液，混合均匀后震荡离心取上层酚相；
[0034] (3-3)在步骤（3-2)中提取的酚相中加入提前预冷的0. 05M至0. 15M的乙酸铵的 甲醇溶液，添加体积比在1:2至2:1之间，静置使蛋白沉淀，并分离得到蛋白质沉淀。
[0035] (3-4)将步骤（3-3)得到的蛋白质沉淀中，加入丙酮洗涤2次，氮气吹干，得到所述 炎症诱导蛋白组分。
[0036] 本发明提供的炎症诱导蛋白组分，具有促炎效果，可用于制备促炎制剂。所述促炎 制剂，相对于现有的脂多糖LPS促炎制剂，效果温和，容易控制，成分天然，无副作用。
[0037] 荔枝"上火"是一种慢性炎症，具有温和、持久的特点。因此，对其荔枝中上火物质 的研宄可能有助于新的比较温和的促炎物质的发现，这对于医学上慢性炎症的研宄也是很 有意义的。本发明分离并纯化了荔枝中能引起温和炎症的炎症诱导蛋白，对其进行质谱鉴 定，并测定了其促炎效果。进而开发了一种新型的促炎制剂，相对于现有的促炎制剂脂多糖 LPS，其效果温和而持久，容易控制用量，更适合作为促炎药物或实验用促炎试剂。
[0038] 以下为实施例：
[0039] 实施例1
[0040] 一种炎症诱导蛋白组分，为荔枝蛋白提取物，命名为LWP，经鸟枪法质谱分析，其肽 段分析结果如表1所示，搜索数据库（uniprot_malvids_14968_20140504)得到的蛋白质分 析结果，如表2所示，表2中详细描述了检测得到的肽段在每个蛋白中的覆盖率。
[0041] 表1蛋白组分shotgun质谱分析结果肽段列表
[0042]
【主权项】
1. 一种炎症诱导蛋白组分，其特征在于，所述炎症蛋白组分为荔枝蛋白提取物，经鸟 枪法质谱分析蛋白，检测得到的肽段覆盖率在10%以上的蛋白质包括:ADP核糖基化因 子1、3_磷酸甘油醛脱氢酶GAPC1、Actin-7、14-3-3样蛋白GF14 A、泛素-40S核糖体蛋 白S27a-l、14-3-3样蛋白GF14?、14-3-3样蛋白GF14u、钙调蛋白1、以及真核起始因子 4A-l〇
2. 如权利要求1所述的炎症诱导蛋白组分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将新鲜荔枝去皮、除核并榨碎制得匀浆，固液分离后保留上清液； (2) 将步骤（1)中制得的上清液浓缩，透析48至96小时得到粗提物，截流量在8KD至 14KD之间； (3) 对步骤（2)中制得的粗提物进行冷冻干燥，并采用酚提法提取蛋白质，经丙酮洗涤 后氮气吹干，得到所述炎症诱导蛋白组分。
3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)所述透析时间为72小时，截流 量为8KDa。
4. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3)所述酚提法提取蛋白质的具体 步骤为： (3-1)称取粗提物冷冻干燥粉末加入预冷的酚提取缓冲液中制得混合液，添加量在 5mg/mL 至 8mg/ml 之间； (3-2)将步骤（3-1)中制得的混合液提纯一次或多次，提纯步骤为：加入等体积预冷的 Tris饱和酚溶液，混合均匀后震荡离心取上层酚相； (3-3)在步骤（3-2)中提取的酚相中加入提前预冷的0. 05M至0. 15M的乙酸铵的甲醇 溶液，添加体积比在1:2至2:1之间，静置使蛋白沉淀，并分离得到蛋白质沉淀。 (3-4)将步骤（3-3)得到的蛋白质沉淀中，加入丙酮洗涤2次，氮气吹干，得到所述炎症 诱导蛋白组分。
5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（3-1)所述的酚提取缓冲液为含有 700mM蔗糖、IOOmM氯化钾、500mM三羟甲基氨基甲烷以及63. 7mM EDTA的水溶液，其pH = 7. 5。
6. -种促炎制剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的炎症诱导蛋白组分。
【专利摘要】本发明公开了一种炎症诱导蛋白组分、其制备方法及产品。所述炎症蛋白组分为荔枝蛋白提取物，其制备方法如下：(1)将新鲜荔枝去皮、除核并榨碎制得匀浆，固液分离后保留上清液；(2)将步骤(1)中制得的上清液浓缩，透析48至96小时得到粗提物，截流量在8KD至14KD之间；(3)对步骤(2)中制得的粗提物进行冷冻干燥，并采用酚提法提取蛋白质，经丙酮洗涤后氮气吹干，得到所述炎症诱导蛋白组分。所述炎症蛋白组分用于制备促炎制剂，其促炎效果明确且温和，易于控制，成分天然无副作用，适合大量生产。
【IPC分类】C07K1-14, A61P35-00, A61K38-00, A61K36-77, C07K1-34, A61K38-44
【公开号】CN104740619
【申请号】CN201510116159
【发明人】马兆成, 王小丽, 邓秀新
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月17日