级种子接种于含0. 1%裂解血球全血马丁肉汤中，置36- 37°C、 100- 120r/min摇床培养24小时，取样作纯粹检验，合格后立即置2-8°C保存，使用期应不 超过3日。
[0015] 将绿脓杆菌和克雷伯氏菌一级种子接种于普通肉汤培养基中，置36-37°C、100- 120r/min摇床培养24小时，取样作纯粹检验，合格后立即置2 - 8°C保存，使用期应不超过 3曰。
[0016] 2.制苗用培养基为营养肉汤或马丁肉汤培养基。
[0017] 3.制苗用菌液制备 (1)菌液培养 将多杀巴氏杆菌二级种子液接种于生物反应器中发酵培养，按培养基量的1% - 2%接 种二级种子液，并按〇. 1%加入裂解血球全血及适量消泡剂，以逐渐增大通气量的方法，在 36-37°C通气条件下培养。溶氧为40%-70%，PH值7. 0-7. 2,转数50-60r/min，培养16- 20小时即可收获菌液。
[0018] 将绿脓杆菌和克雷伯氏菌二级种子液接种于生物反应器中发酵培养，按培养基量 的1% - 2%接种二级种子液，同时加入适量消泡剂，以逐渐增大通气量的方法，在36-37°C 通气条件下培养。溶氧为40%-70%，PH值7. 0 - 7. 2,转数50-60r/min，培养16 - 20小时 即可收获菌液。
[0019] (2)纯粹检验 绿脓杆菌、克雷伯氏菌及多杀巴氏杆菌三种菌液培养完成后，取样用普通琼脂或马丁 琼脂作纯粹检验，结果均应纯粹。
[0020] (3)活菌计数 用含0. 1%裂解血球全血及4%健康动物血清的普通琼脂或马丁琼脂平板，分别对绿脓 杆菌、克雷伯氏菌及多杀巴氏杆菌进行活菌计数，计数结果作为配苗时的依据。
[0021] 4?灭活 分别对绿脓杆菌、克雷伯氏菌及多杀巴氏杆菌三种菌液进行灭活，按菌液总量的 0. 2% - 0. 4%缓慢加入甲醛溶液，经37°C灭活24小时，期间搅拌数次，然后用普通琼脂或马 丁琼脂作灭活检查，培养基上应无菌生长。
[0022] 5?离心 采用15000- 20000r/min连续离心机分别对绿脓杆菌、克雷伯氏菌及多杀多杀巴氏杆 菌三种菌液进行离心，然后收集离心后的菌泥，用高压灭菌的PBS进行适当稀释，抽样进行 无菌检验，结果均应无细菌生长。
[0023] 6?配苗与分装 将三种灭活离心后检验合格的菌液等量混合，取混合后的菌液再与佐剂混合，同时按 总量的万分之一加入硫柳汞，充分搅拌混匀，用7. 5%NaHC(yK溶液调PH值7. 2-7. 4。混合 均匀，每瓶定量分装l〇〇ml，密封瓶口，制成水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌和多杀巴氏杆菌三联 灭活疫苗（以下简称：本发明疫苗)。
[0024] 7?成品检验 物理性状：本品为均匀混悬液，静止后，上层为浅红色的液体，下层为灰白色沉淀，震摇 后呈均匀混悬液。
[0025] 无菌检验：按《中华人民共和国兽药典》（2010年版）附录42页进行检验，无细菌 生长。
[0026] 安全检验：用7-8周龄健康易感水貂10只，各皮下注射疫苗2ml，观察10日，所 有接种水貂的精神、食欲、体温、粪便均应正常。
[0027] 效力检验：用7-8周龄健康易感水貂30只，分两组，每组15只，其中一组各肌肉 注射本发明疫苗lml，另一组作对照，在同条件下饲养14日后攻击强毒。
[0028] 水貂绿脓杆菌：选取免疫组5只水貂和对照组5只水貂，进行水貂绿脓杆菌活菌攻 毒，观察10日，对照组水貂全部死亡，免疫组水貂至少保护4只；或对照组水貂死亡4只，免 疫水貂全部保护为合格。检验结果见表1。
[0029] 克雷伯氏菌：选取免疫组5只水貂和对照组5只水貂，进行肺炎克雷伯氏菌活菌攻 毒，观察14日，对照组水貂全部死亡，免疫组水貂至少保护4只；或对照组水貂死亡4只，免 疫水貂全部保护为合格。检验结果见表1。
[0030] 多杀巴氏杆菌：选取免疫组5只水貂和对照组5只水貂，进行多杀巴氏杆菌活菌攻 毒，观察14日，对照组水貂全部死亡，免疫组水貂至少保护4只；或对照组水貂死亡4只，免 疫水貂全部保护为合格。检验结果见表1。
[0031] 表1本发明疫苗效力检验结果
【主权项】
1. 一种水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌、多杀巴氏杆菌三联灭活疫苗，其特征在于，该疫苗 由抗原和常规疫苗佐剂组成，所述抗原包括水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌和多杀巴氏杆菌，其 中，多杀巴氏杆菌的保藏号为：CGMCC No: 10334;保藏时间：2015年Ol月09日；保藏在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为多杀巴氏杆菌 Iimttocida0
2. 如权利要求1所述的水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌、多杀巴氏杆菌三联灭活疫苗，其特 征在于：所述疫苗中水貂绿脓杆菌灭活前的细菌浓度不少于30亿CFU/mL ;克雷伯氏菌灭活 前的细菌浓度不少于20亿CFU/mL ;多杀巴氏杆菌灭活前的细菌浓度不少于30亿CFU/mL。
3. 如权利要求1所述的水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌、多杀巴氏杆菌三联灭活疫苗的制 备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 将水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌和多杀巴氏杆菌菌株分别培养繁殖其生产用种子，并 进行纯粹检验； 2) 将上述用于生产的水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌和多杀巴氏杆菌种子液分别接种到生 物反应器培养基中进行发酵增殖培养，同时，对该产物进行纯粹检验及活菌计数； 3) 将增殖培养后的三种菌株进行灭活，制得灭活抗原液，并对该产物进行灭活检验和 无菌检验； 4) 将灭活后且检验合格的灭活抗原液离心处理，15000rpm -20000rpm连续离心，弃去 上清收集菌泥，并对菌泥按一定比例进行稀释，置2-8°C条件下保存； 5) 将用于生产的水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌和多杀巴氏杆菌三种灭活且处理后的三种 等量抗原与佐剂混合，制备水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌、多杀巴氏杆菌三联灭活疫苗，并进 行物理性状检验、无菌检验、安全检验、效力检验和甲醛硫柳汞残余量检验； 6) 水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌、多杀巴氏杆菌三联灭活疫苗分装、贮存。
【专利摘要】本发明公开了一种水貂绿脓杆菌、克雷伯氏菌、巴氏杆菌三联灭活疫苗，该疫苗由已灭活的绿脓杆菌、克雷伯氏菌、巴氏杆菌作为抗原组成，可同时预防水貂的绿脓杆菌病、克雷伯氏菌病和巴氏杆菌病以及三者的混合感染。该疫苗副作用小，协同增效具有较好的免疫原性及安全性，可达到一针多防的效果，减化了疫苗接种的免疫程序，提高了保护效率。CGMCC No: 1033420150109
【IPC分类】A61P31-04, A61K39-108, A61K39-104, A61K39-102
【公开号】CN104740622
【申请号】CN201510115965
【发明人】张中洋, 张国军, 扈荣良, 吴金, 张守峰, 刘晔, 王宏宇
【申请人】吉林和元生物工程有限公司
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月17日