磷酸酶和张力蛋白同系物(pten)抑制剂组合物,用途以及方法
【专利说明】磷酸酶和张力蛋白同系物（PTEN)抑制剂组合物，用途以及 方法
[0001] 本申请要求于2009年10月16日提交的美国临时申请号61/272, 655的优先权。
技术领域
[0002] 本发明涉及用于治疗与细胞毒性或刺激毒性应激相关的不同适应症的治疗法，它 们的用途以及方法。具体地是肽类以及它们的组合物，它们具有在其中使用的磷酸酶和张 力蛋白同系物（PTEN)抑制活性以及用于治疗与细胞毒性或刺激毒性应激相关适应症的方 法。
[0003] 发明背景
[0004] 磷酸酶和张力蛋白同系物（PTEN)是据报道涉及多种癌类型进展的一种肿瘤抑制 因子（Li 等人 1997;Steck等人 1997;Baker2007)。PTEN 是磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K) / AKT途径的一种负调节物-失去PTEN导致PI3K/AKT信号级联的活化并且导致增加的细胞 生长和增殖。PTEN还显示具有与PI3K/AKT信号传导不相关的其他功能-例如，在通过与着 丝粒物理地相互作用维持染色体稳定性以及控制DNA修复方面（Shen等人2007)。PTEN已 经隐含在多种非癌适应症中，例如中风，其中用siRNA下调PTEN已经显示在转染的神经元 中具有抗局部缺血神经元损伤的神经保护作用（Ning等人2004)。
[0005] PTEN的定位和降解已经显示涉及翻译后修饰，特别是泛素化作用（Trotman等人 2007 ;Wang等人2007 ;Wang等人2008)。PTEN主要定位到细胞质中，但是已知一种独特集 合的PTEN定位到细胞核中（综述见（Lian和Di Cristofano 2005))。当PTEN不包含典型 的细胞核定位信号时，它的确包含两个PEST结构域，这些结构域通常发现于靶向用于通过 泛素化作用降解的蛋白中。实际上，多泛素化作用已经显示主要靶向PTEN用于细胞降解 (Wang等人2007)，而单泛素化作用主要涉及PTEN核转位（Trotman等人2007)。PTEN蛋白 序列中两个特异性泛素化位点（K13和K289)已经显示直接涉及PTEN核转位-这些位点之 一的单泛素化作用显示足以用于核转位。这两个位点之一的突变显著地抑制了 PTEN的核 转位（Trotman 等人 2007)。
[0006] 尚不清楚的是核转位是否发生在中枢神经细胞中，并且如果发生的话，用于PTEN 的这种核转位的机理是否与至今已经试验过的其他细胞中的相同。
[0007]发明概述
[0008] 本发明部分地基于这种出人意料的发现，即在神经元细胞中PTEN的K13泛素化位 点的突变显著地降低了 PTEN的核转位，而在相同细胞中PTEN的K289泛素化位点的突变未 显著地影响PTEN的核转位。此外，出人意料的是被设计成干扰PTEN的K13泛素化位点处 泛素化作用的某些新型肽类：1)在神经元细胞培养物中阻断了 NMDA-诱导的PTEN核转位； 2)在神经元培养物中阻断了 NMDA诱导的刺激毒性神经元损伤；3)在大鼠局部缺血模型中 体内地阻断了 PTEN核转位；4)当中风后给药时，在大鼠局部缺血模型中体内地减少了中风 相关梗死区；5)当中风后给药时，在大鼠局部缺血模型中体内地改善了中风相关长期运动 行为恢复；6)在ALS的转基因动物模型中改善了行为结果；以及7)在大鼠体内局部脑缺血 之后促进了脑内地移植到梗死区中的iPS-NPC(干细胞）的存活；而当与设计成在PTEN的 K289位点处干扰泛素化作用的肽类比较时，不显示这类特性。
[0009] 在本发明的某些方面中，提供了一种分离的多肽组合物，该多肽组合物具有基本 上类似于SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO:6的氨基酸组成。其 中基本上类似是指当比较等效区域时（即约14个氨基酸），包括一种序列一致性程度。此 外，基本上类似是指包括保守取代以及修饰的氨基酸，其条件是针对PTEN K-13在此说明的 PTEN抑制活性或其他活性得以维持。
[0010] 根据一个实施方案，提供了包括SEQ ID NO: 1的一种分离的多肽或包括与SEQ ID NO: 1具有至少90% -致性的8-14个氨基酸序列的一种多肽，或包括与SEQ ID NO: 1的对应 氨基酸具有至少90% -致性的8-14个氨基酸序列的一种多肽，其条件是SEQ ID NO: 1的位 置8是赖氨酸（K)，并且其中该多肽具有磷酸酶和张力蛋白同系物（PTEN)抑制活性。分离 的多肽可以进一步包括结合到分离的多肽上的一个递送和靶向（dat)部分。该dat部分可 以是选自下面的一项或多项：配体类、受体类、蛋白转导结构域类（PTD)、或抗体类。该dat 部分可以是一种PTD。该分离的多肽可以包括选自SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6的一种氨基酸序列。该dat部分可以是选自：触角足同源结构域、白喉毒素易位结构 域、炭疽毒素易位结构域、假单胞菌外毒素a易位结构域、皮抑菌肽s4、hsv_lvp22、pep-1、 tat蛋白转导结构域、聚-1-赖氨酸、以及聚-d-赖氨酸。该多肽可以包括SEQ ID NO: 2。 [0011] 根据一个实施方案，提供了包括SEQ ID NO: 1的一种分离的多肽或包括与SEQ ID NO: 1具有至少90% -致性的8-14个氨基酸序列的一种多肽，或包括与SEQ ID NO: 1的对应 氨基酸具有至少90% -致性的8-14个氨基酸序列的一种多肽，其条件是SEQ ID NO: 1的位 置8是赖氨酸（K)，并且其中该多肽保护细胞免受细胞毒性应激或刺激毒性应激。分离的多 肽可以进一步包括结合到分离的多肽上的一个递送和靶向（dat)部分。该dat部分可以是 选自下面的一项或多项：配体类、受体类、蛋白转导结构域类（PTD)、或抗体类。该dat部分 可以是一种PTD。该分离的多肽可以包括选自SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6 的一种氨基酸序列。该dat部分可以是选自：触角足同源结构域、白喉毒素易位结构域、炭 疽毒素易位结构域、假单胞菌外毒素a易位结构域、皮抑菌肽s4、hsv-lvp22、pep_l、tat蛋 白转导结构域、聚-1-赖氨酸、以及聚-d-赖氨酸。该多肽可以包括SEQ ID NO: 2。
[0012] 根据另一个实施方案，提供了一种分离的多核苷酸，该多核苷酸包括对在此所述 多肽进行编码的一种核苷酸序列。该多核苷酸可以编码包括SEQ ID NO: 1的一种分离的多 肽或包括与SEQ ID NO: 1具有至少90% -致性的8-14个氨基酸序列的一种多肽，或包括 与SEQ ID NO: 1的对应氨基酸具有至少90% -致性的8-14个氨基酸序列的一种多肽，其条 件是SEQ ID NO: 1的位置8是赖氨酸（K)，并且其中该多肽具有磷酸酶和张力蛋白同系物 (PTEN)抑制活性。
[0013] 根据另一个实施方案，提供了一种组合物，该组合物包括在此所述的一种多肽和 一种载体。该多肽可以包括选自下面一项或多项的一种多肽：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、 SEQ ID N0:5、以及SEQ ID N0:6,或与其基本上类似的一种氨基酸组合物。该载体可以是选 自下组：一种固相支撑体、一种稳定剂、一种防腐剂、以及一种药学上可接受的载体。
[0014] 根据另一个实施方案，提供了在此所述的一种分离的多肽，该多肽已经被重组地 生产并且从细胞中分离。
[0015] 根据另一个实施方案，提供了包含一种分离多核苷酸的载体，该多核苷酸包括对 在此所述多肽进行编码的一种核苷酸序列。该多核苷酸可以编码包括SEQ ID NO: 1的一种 分离的多肽或包括与SEQ ID NO: 1具有至少90% -致性的8-14个氨基酸序列的一种多肽， 或包括与SEQ ID NO: 1的对应氨基酸具有至少90% -致性的8-14个氨基酸序列的一种多 肽，其条件是SEQ ID N0:1的位置8是赖氨酸（K)，并且其中该多肽具有磷酸酶和张力蛋白 同系物（PTEN)抑制活性。
[0016] 根据另一个实施方案，提供了包括在此所述的一种多核苷酸或在此所述的一种载 体的一种细胞，其中该核苷酸可操作地连接到一个表达控制序列上。
[0017] 根据另一个实施方案，提供了保护细胞免受细胞毒性应激或刺激毒性应激的一种 方法，该方法包括将选自下面一项或多项的一种多肽递送到细胞中：SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:5、以及 SEQ ID N0:6。
[0018] 根据另一个实施方案，提供了保护细胞免受细胞毒性应激或刺激毒性应激的一种 方法，该方法包括（a)将包括如权利要求13所述多核苷酸的载体递送到细胞中；以及（b) 表达由该载体携带的序列。
[0019] 根据另一个实施方案，提供了表达一种多肽的方法，包括：(a)提供对该多肽进 行编码的一种表达载体，其中该多肽是选自下面一项或多项：SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、 SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6 ;(b)将该载体引入到细胞中；以及（c)在允许表达的条件下维 持细胞。将载体引入到细胞中可以体内进行。将载体引入到细胞中可以离体进行。将载体 引入到细胞中可以体外进行。
[0020] 根据另一个实施方案，提供了用于治疗与细胞毒性应激相关疾病的一种方法，包 括将一个生物学有效量的PTEN抑制剂施用到需要它的受试者体内，该抑制剂包括SEQ ID NO: 1的一种分离的多肽，或包括与SEQ ID NO: 1具有至少90% -致性的14个氨基酸序列 的一种多肽或包括与SEQ ID NO: 1具有至少90% -致性的8-14个氨基酸序列的一种多肽， 或包括与SEQ ID NO: 1的相应氨基酸具有至少90% -致性的8-14个氨基酸序列的一种多 肽，其条件是SEQ ID NO: 1的位置8是赖氨酸（K)，并且其中该多肽具有磷酸酶以及张力蛋 白同系物（PTEN)抑制活性。该细胞毒性应激可以是刺激毒性应激。
[0021] 根据另一个实施方案，提供了用于在干细胞移植之后增强干细胞存活的一种方 法，包括将一个生物学有效量的下面各项施用到需要它的受试者体内：包括SEQ ID NO: 1的 一种分离的多肽，或包括与SEQ ID NO: 1具有至少90% -致性的14个氨基酸序列的一种多 肽或包括与SEQ ID NO: 1具有至少90% -致性的8-14个氨基酸序列的一种多肽，或包括与 SEQ ID NO: 1的相应氨基酸具有至少90% -致性的8-14个氨基酸序列的一种多肽，其条件 是SEQ ID N0:1的位置8是赖氨酸（K)，并且其中该多肽具有磷酸酶以及张力蛋白同系物 (PTEN)抑制活性。
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