包含5型磷酸二酯酶抑制剂的神经细胞的细胞凋亡抑制用组合物的制作方法
【专利说明】包含5型磷酸二酯酶抑制剂的神经细胞的细胞凋亡抑制用 组合物 【技术领域】
[0001] 本发明涉及包含5型磷酸二酯酶（phosphodiesterase type 5)活性抑制剂的脑 神经细胞的细胞凋亡（apoptosis)抑制用组合物、保健功能食品及细胞凋亡的抑制方法。 【【背景技术】】
[0002] 磷酸二酯酶（PDE，phosphodiesterase)为对在细胞中分别使用5-腺苷酸及5-鸟 昔酸来使环腺昔酸（cAMP，cyclic adenosine monophosphate)和/或环鸟昔酸（cGMP， cyclic guanosine monophosphate)水解的作用进行催化的酶，由此，这些对环腺苷酸或 环鸟苷酸水平的细胞性调节重要。众所周知，至今已知的磷酸二酯酶共有11种（Nature， 674-682(2002))。据报告，在上述磷酸二酯酶中，5型磷酸二酯酶为分解环鸟苷酸来生成 5' -鸟苷酸的酶，因而若抑制上述5型磷酸二酯酶，则维持环鸟苷酸的浓度来持续勃起 (Boolel, M. et al.，Br. J. of Urology, 78, 257-261 (1996))。由此，5 型磷酸二酯酶抑制剂使 用为勃起功能障碍治疗剂。
[0003] 众所周知，这种5型磷酸二酯酶抑制剂有很多化合物。万艾可（Viagra)?(通用 名：西地那非；W0 94/28902)为美国食品药品监督管理局（FDA)认可的最初男性用勃起功 能障碍治疗剂，并且，许可了西力士（Cialis)?(通用名：他达拉非；W0 95/19978)及艾力 达（Levitra)?(通用名：伐地那非；Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters)。众所周 知，5型磷酸二酯酶抑制剂还有Mvix?(通用名：米罗那非；KR0358083)。众所周知，如上所 述的药剂呈现优秀的治疗效果，来改善约70%的患者的性功能。众所周知，5型磷酸二酯 酶抑制剂的其他医药用途有门脉高压症、肝-肾综合症、肝-肺综合症的治疗效果（韩国公 开特许第10-2012-0024807号），据报告，还有改善哺乳动物的生殖能力（韩国公开特许第 1〇- 2〇〇2_0〇31〇62 号）的效果。
[0004] 并且，据报告，作为5型磷酸二酯酶抑制剂的西地那非及伐地那非诱导B-慢 性淋巴细胞白血病细胞（B-chronic lymphocytic leukemia cells)的胱天蛋白酶 (caspase) -依赖性细胞凋亡（Marika Sarfati et al.，BLOOD, VOLUME 101，NUMBER 1(2003)) 〇
[0005] 本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文及 专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的技术 领域的水平及本发明的内容。 【
【发明内容】
】
[0006]【技术问题】
[0007] 本发明人在对5型磷酸二酯酶抑制剂进行研究的过程中，发现了5型磷酸二酯酶 抑制剂在脑神经细胞中反而抑制细胞凋亡。具体地，将5型磷酸二酯酶抑制剂给药到由脑 损伤诱发神经细胞的细胞凋亡的动物模型中，其结果确认到显著抑制了脑神经细胞的细胞 凋亡，并通过抑制神经细胞的细胞凋亡来保护神经细胞的效果，改善动物模型的认知及运 动功能的降低，从而完成了本发明。
[0008] 【解决问题的手段】
[0009] 本发明的目的在于，提供脑神经细胞的细胞凋亡抑制用药剂学组合物。
[0010] 本发明的再一目的在于，提供脑神经细胞的细胞凋亡抑制用保健功能食品。
[0011] 本发明的另一目的在于，提供脑神经细胞的细胞凋亡的抑制方法。
[0012] 根据以下发明的详细说明、发明要求保护范围及附图更加明确本发明的其他目的 及优点。
[0013] 【发明效果】
[0014] 归纳本发明的特征及优点如下：
[0015] (i)本发明提供包含5型磷酸二酯酶抑制剂的脑神经细胞的细胞凋亡抑制用组合 物、保健功能食品及细胞凋亡的抑制方法。
[0016] (ii)根据本发明，5型磷酸二酯酶抑制剂抑制脑神经细胞的细胞凋亡，来呈现对 神经细胞的保护作用。
[0017] (iii)本发明的组合物可抑制脑神经细胞的细胞凋亡来预防、改善及治疗脑神经 疾病。 【【附图说明】】
[0018] 图1为示出米罗那非的神经细胞保护效果（脑萎缩性、退行性神经元、胱天蛋白 酶-3及聚（腺苷二磷酸_核糖）聚合酶）的组织病理学照片。
[0019] A :假手术对照（Sham)组
[0020] B :神经细胞凋亡对照组
[0021] C :0? 5mg/kg的米罗那非给药组
[0022] D :lmg/kg的米罗那非给药组
[0023] E :2mg/kg的米罗那非给药组
[0024] 比例尺=100 um
[0025] 箭头表示近端大脑中动脉。
[0026] 图2示出借助米罗那非处理的动物模型的体重变化。
[0027] 图3为示出米罗那非的神经细胞保护效果（脑萎缩性、退行性神经元、胱天蛋白 酶-3及聚（腺苷二磷酸_核糖）聚合酶）的脑切片的组织病理学照片。
[0028] A :假手术对照组
[0029] B :神经细胞凋亡对照组
[0030] C :手术后24小时开始将lmg/kg的米罗那非进行给药的实验组
[0031] D :手术后72小时开始将lmg/kg的米罗那非进行给药的实验组
[0032] E :手术后168小时开始将lmg/kg的米罗那非进行给药的实验组
[0033] 比例尺=100 ym
[0034] 箭头表示神经细胞凋亡手术（大脑损伤）的东侧面。
[0035] 图4示出米罗那非处理时期的动物模型的体重变化。
[0036] 图5示出米罗那非处理时期的前肢放置检查的变化。
[0037] 与基于最小显著差异（LSD)试验的假手术对照组进行比较，ap < 0. 01。
[0038] 与基于最小显著差异试验的神经细胞凋亡对照组进行比较，bp < 0. 01。
[0039] 与基于丽试验的假手术对照组进行比较，ep< 0. 01。
[0040] 图6示出米罗那非处理时期的后肢放置检查的变化。
[0041] 与基于最小显著差异试验的假手术对照组进行比较，ap < 0. 01及bp < 0. 05。
[0042] 与基于最小显著差异试验的神经细胞凋亡对照组进行比较，p < 0. 01。
[0043] 与基于丽试验的假手术对照组进行比较，dp< 0. 01。
[0044] 图7示出米罗那非处理时期的身体摇摆的变化。值由8只大鼠的平均值（mean) 土 标准差（SD)来表示。
[0045] 与基于最小显著差异试验的假手术对照组进行比较，ap < 0. 01。
[0046] 与基于最小显著差异试验的神经细胞凋亡对照组进行比较，bp < 0. 01。
[0047] 图8示出米罗那非处理时期的认知运动行为（水迷宫检查）的变化。值由8只大 鼠的平均值土标准差来表示。
[0048] 与基于最小显著差异试验的假手术对照组进行比较，ap < 0. 01及bp < 0. 05。
[0049] 与基于最小显著差异试验的神经细胞凋亡对照组进行比较/p < 0. 01、dp < 0. 05。
[0050] 与基于最小显著差异试验的假手术对照组进行比较，ep < 0. 01。
[0051] 与基于最小显著差异试验的神经细胞凋亡对照组进行比较，fp < 0.01及5 < 0? 05〇
[0052]【最佳实施方式】
[0053] 根据本发明的一实施方式，本发明提供脑神经细胞的细胞凋亡抑制用药剂学组合 物，其包含：（i) 5型磷酸二酯酶（phosphodiesterase type 5)活性抑制剂的药剂学有效剂 量；以及（ii)药剂学上接受的载体。
[0054] 根据本发明的再一实施方式，本发明提供抑制脑神经细胞的细胞凋亡的方法，上 述抑制脑神经细胞的细胞凋亡的方法包括将包含5型磷酸二酯酶（phosphodiesterase type 5)活性抑制剂的组合物以有效剂量给药到需要上述组合物的个体（subject)的步 骤。
[0055] 根据本发明的另一实施方式，本发明提供改善认知功能障碍或运动功能障碍 的方法，上述改善认知功能障碍或运动功能障碍的方法包括将包含5型磷酸二酯酶 (phosphodiesterase type 5)活性抑制剂的组合物以有效剂量给药到需要上述组合物的 个体（subject)的步骤。
[0056] 本发明人在对5型磷酸二酯酶抑制剂进行研究的过程中，发现了 5型磷酸二酯酶 抑制剂在脑神经细胞中反而抑制细胞凋亡。具体地，将5型磷酸二酯酶抑制剂给药到由脑 损伤诱发神经细胞的细胞凋亡的动物模型中，其结果确认到显著抑制了脑神经细胞的细胞 凋亡，并通过抑制神经细胞的细胞凋亡来保护神经细胞的效果，改善动物模型的认知及运 动功能的降低。
[0057] 在本说明书中，术语"5型磷酸二酯酶活性抑制剂"或"5型磷酸二酯酶抑制剂"是 指可对5型磷酸二酯酶的催化作用选择性或非选择性地抑制或减少的物质。上述5型磷酸 二酯酶抑制剂包含化合物、肽、小分子、抗体或其的片段及天然提取物。
[0058] 在一特定例中，上述5型磷酸二酯酶抑制剂为化合物。
[0059] 根据本发明的一实例，上述5型磷酸二酯酶抑制剂选自由米罗那非 (mirodenafil)、西地那非（sildenafil)、伐地那非（vardenafil)、他达拉非（tadalafil)、 乌地那非（udenafil)、达生他非（dasantafil)、阿伐那非（avanafil)以及它们的药剂学上 接受的盐、溶剂化物及水合物组成的组中。
[0060] 在一特定例中，上述5型磷酸二酯酶抑制剂为米罗那非、西地那非、伐地那非或它 们的药剂学上接受的盐。
[0061] 上述药剂学上接受的盐是指对将化合物进行给药的有机体不诱发严重的刺激，并 防止化合物的生物学活性和物性受损的、化合物的剂型。上述药剂学上接受的盐为药剂学 上可接受的、以利用实质上非毒性的有机酸及无机酸的该领域中众所周知的通常的方法制 备而得的盐。上述酸包含盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸、甲磺酸（methanesulfonic acid)、乙横酸（ethanesulfonic acid)、对甲苯横酸（p-toluenesulfonic acid)等横酸、酒 石酸、甲酸、朽1檬酸、醋酸、三氯醋酸（trichloroacetic acid)、三氟醋酸（trifluoroacetic acid)、癸酸、异丁酸、丙二酸、丁二酸、邻苯二甲酸、葡萄糖酸、苯甲酸、乳酸、富马酸、马来酸 及水杨酸等有机酸。并且，也可使本发明的化合物和碱发生反应来形成铵盐、钠或钾盐等碱 金属盐、钙或镁盐等碱土金属盐等盐、二环己胺（dicyclohexylamine)、N-甲基-D-葡糖胺 (N-methyl-D-glucamine)、三（轻甲基）甲胺（tris(hydroxymethyl)methylamine)等有机 碱的盐以及精氨酸、赖氨酸等氨基酸盐。
[0062] 根据本发明的一实例，上述药剂学上接受的盐为米罗那非盐酸盐、西地那非柠檬 酸盐或伐地那非盐酸盐。
[0063] 上述水合物（hydrate)是指包含借助非共价分子间力（non-covalent intermolecular force)结合的化学计量（stoichiometric)或非化学计量 (non-stoichiometric)的水的本发明的化合物或它们的盐。
[0064] 上述溶剂化物（solvate)是指包含借助非共价分子间力结合的化学计量或非化 学计量的溶剂的本发明的化合物或它们的盐。与其相关的优选溶剂为挥发性、非毒性和/ 或适于给药到人的溶剂。
[0065] 如在以下实施例中所证明，包含上述5型磷酸二酯酶抑制剂作为有效成分的本发 明的组合物抑制脑神经细胞的细胞凋亡来保护神经细胞。在本说明书中，术语"神经细胞" 包含中枢神经系统、脑、脑干、脊髓、形成中枢神经系统和末梢神经系统的接合部分等的结 构的神经元、神经支持细胞、神经胶质及施万细胞等。在本说明书中，术语"神经细胞的保 护"是指减轻或改善（amelioration)神经性损伤（nervous insult)的作用、或减轻或抑 制由神经性损伤引起的神经细胞的细胞凋亡的作用、或保护或恢复受到神经性损伤的神经 细胞的作用。并且，在本说明书中，术语"神经性损伤"是指由多种原因（如外伤性脑损伤 之类的外部因素、遗传原因、代谢原因、毒性原因、神经毒性原因、生理原因及生物化学原因 等）导致的神经细胞或神经组织的损伤。