为了大脑皮质的组织病理学检查，实施苏木精和伊红（H&E)染色。在苏木精和伊红染色 条件下，通过组织形态测定术（Histomorphometry)计算了大脑皮质的萎缩性％ (cerebral atrophic%)及退行性神经元（degenerative neurons，呈现为嗜酸性粒细胞）的数量。为 了分析，未向组织病理学者提供组的编采的信息。
[0205] 组织形态测定：与制备的组织染色标本的完整的对侧性（contralateral)半球进 行比较，并按照以下数学公式4计算了同侧性（ipsilateral)大脑皮质的萎缩％。并且，测 定了每单位面积（_ 2)的退行性神经元的数量。
[0206]【数学公式4】
[0207] 形成脑萎缩=(对侧性大脑皮质的面积一同侧性大脑皮质的面积）/对侧性大脑 皮质面积X100 (% )
[0208] 【6?体重测定】
[0209] 诱发神经细胞凋亡1天前、诱发当天及诱发之后1天、7天、14天、21天、28天及29 天测定了体重。为了减小各个动物之间的差异，按照以下数学公式5计算了诱发神经细胞 凋亡之后体重的增加量和连续性的试验物质的给药。
[0210]【数学公式5】
[0211] 诱发神经细胞凋亡之后29天期间的体重增加量=(诱发神经细胞凋亡29天之后 的体重一神经细胞凋亡诱发各天的体重）
[0212] 【7?感觉运动功能评价（sensorimotor function assessment) -神经学运动行为 检查】
[0213]利用肢体放置检查（limb placing test ;de Ryck M et al.，Stroke. 20:1383-90 (1989))及身体摇摆检查（body swing ;Borlongan and Sanberg，J Neurosci. 15:5372-8(1995))来评价了感觉运动功能。检查在诱发神经细胞凋亡之后第1 天及第28天执行。未向负责评价的检查员提供实验物质处理的信息。
[0214] 肢体放置检查：独立评价了前肢及后肢的放置。为了前肢放置检查，使大鼠的前 肢处于自由的状态，抓住躯干慢慢地向桌子上端的边缘移动，停止对大鼠胡须的短的触摸 (用于视觉所诱导的放置），触摸大鼠的胡须（用于胡须所诱导的放置），直到上述桌子上端 的边缘向前肢的前面照射光（用于触觉所诱导的放置），借助所增加的压力向桌子的边缘 伸出前肢（用于本体感受所诱导的放置）。按照上述方法评价了后肢放置。按照以下的基 准对视觉、胡须、触觉及本体感受刺激的各个肢体的反应进行了评分化（在前肢试验中总 分为12分，在后肢试验中6分意味着最大神经缺损，0分意味着正常行为）。
[0215] 正常行为=〇分；
[0216] 单侧肢体表现（performance with unilateral limb) = 1 分；
[0217] 延迟（2秒钟）和/或不完全行为=2分；
[0218] 无行为=3分。
[0219] 身体摇摆检查：从尾端约2cm的位置抓住实验动物之后，向桌子表面上以1英寸的 方式进行增加。每当大鼠将头部从垂直轴移动10°以上之后重新回到垂直姿势时，记录了 摇摆（swing)。对每只动物计算了共30次的摇摆。由于向右半球诱发神经细胞凋亡之后， 实验动物存在向相反的脑（左侧）侧摇摆的倾向，因而作为恢复率的测定，与完整动物的分 数记录一同记录了向右侧的摇摆数及百分比。
[0220] 【8?认知运动行为评价（cognitive motor behavior assessment)】
[0221] 为了认知检查，实施了水迷宫检查（J Neurosci Methods. 11:47-60(1984))。神 经细胞凋亡诱发14天及28天之后，在填满22. 0±1. 0°C温度的水的暗颜色的罐（直径 150cmX高度50cm)中，以隔10分钟的方式实施了 3次。将15X30cm的水中平台（从水的 表面2mm以下）放置于水槽的西北象限（northwest quadrant)。使释放点（release point) 始终朝向水槽的南侧。以与水槽的壁相向的方式使实验动物入水之后进行释放。利用摄像 机跟踪系统（Smart junior，PanLab，西班牙）来对各实施中的实验动物的游泳路径进行了 记录，并计算了到达逃避平台（escape platform)为止移动的距离（m)及时间（秒钟）。
[0222] 【9?统计分析】
[0223] 所有数据都由10只大鼠的平均值土标准差（S.D.)表示。执行了用于服用量 不同的组的多重比较检查。利用Levene试验（Levene A, Clin Otalary, 1981;6:145-51) 来调查了方差齐性（Variance homogeneity)。若Levene试验结果为从方差齐性导出无 显著性的偏差的情况下，为了确定组比较的哪一对组显著不同，根据单向方差分析试验 (one-way AN0VA test)之后的最小显著差异（LSD)多重比较试验来分析了得到的数据。 并且，在Levene试验中观察到从方差齐性具有显著性的偏差的情况下，执行了非参数比较 试验（non-parametric comparison test)及克鲁斯凯-沃里斯试验（Kruskal-Wallis H test)。在克鲁斯凯-沃里斯试验中观察到具有显著性的差异的情况下，为了确定呈现显著 不同的差异的特定组对，执行了 Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W test。统计学分析 使用统计产品与服务解决方案（SPSS) (Release 14K，SPSS Inc.，USA ;Ludbrook，Clin Exp Pharmacol Physiol，1997;24:294-6)来执行。并且，为了对试验物质的效率的理解，根据 以下数学公式6及数学公式7计算了神经细胞凋亡对照组和米罗那非处理实验组之间的变 化。
[0224] 【数学公式6】
[0225] 与假手术对照组进行比较的百分比变化（％ ) = [((神经细胞凋亡对照组的数 据一假手术对照组的数据）/假手术对照组的数据）X100]
[0226] 【数学公式7】
[0227] 与神经细胞凋亡对照组进行比较的百分比变化（％ ) = [((米罗那非处理组的数 据一神经细胞凋亡对照组的数据）/神经细胞凋亡对照组的数据）X100]
[0228]【实验结果】
[0229] 【1. 5型磷酸二酯酶抑制剂的神经细胞凋亡抑制效果】
[0230] 在受损伤的脑组织周边部位的病理学标本中，在神经细胞凋亡对照组中，确认到 作为诱发部位的右侧大脑半球的具有显著性的（P < 〇. 01)显著萎缩和在每单位面积（mm2) 大脑皮质内的变性神经元、胱天蛋白酶-3及聚（腺苷二磷酸-核糖）聚合酶免疫反应细胞 的数量增加。相反，在分别将lmg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，从手术24小时及72 小时之后开始确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的（P < 0.01)大脑半球的 萎缩抑制，并观察到大脑皮质内的变性神经元、胱天蛋白酶-3及聚（腺苷二磷酸-核糖） 聚合酶免疫反应细胞的数量减少，手术168小时之后开始，在lmg/kg的米罗那非给药组中， 也确认到与对照组相比更具有显著性的（P< 0.05)大脑半球的萎缩抑制、大脑皮质内的变 性神经元及聚（腺苷二磷酸-核糖）聚合酶免疫反应细胞的数量减少，还确认到胱天蛋白 酶-3免疫反应细胞的显著减少（表9及图3)。
[0231]【表9】
[0232]
[0233] 具体地，作为诱发部位的右侧大脑半球的萎缩程度在神经细胞凋亡对照组中，与 假手术对照组相比，呈现了 1581. 66%的变化，但手术（通过大脑右半球损伤的神经细胞凋 亡的诱发）24小时、72小时及168小时之后开始，在将lmg/kg的米罗那非进行给药的实验 组中，与神经细胞凋亡对照组相比，呈现了 -60. 71%、-26. 37%及-12. 31 %的变化。
[0234] 在作为诱发部位的右侧大脑皮质中，每单位面积的变性神经元的数量在神经细胞 凋亡对照组中，与假手术对照组相比，呈现了 1625. 83%的变化，但手术24小时、72小时及 168小时之后开始，在将lmg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，与神经细胞凋亡对照组 相比，呈现了 -70. 64%、-45. 90%及-15. 40% 的变化。
[0235] 在作为诱发部位的右侧大脑皮质中，每单位面积的胱天蛋白酶-3免疫反应神经 元的数量在神经细胞凋亡对照组中，与假手术对照组相比，呈现了 1360. 00%的变化，但手 术24小时、72小时及168小时之后开始，在将lmg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，与 神经细胞凋亡对照组相比，呈现了 -57. 29%、-40. 63%及-15. 57%的变化。
[0236] 在作为诱发部位的右侧大脑皮质中，每单位面积的聚（腺苷二磷酸-核糖）聚 合酶免疫反应神经元的数量在神经细胞凋亡对照组中，与假手术对照组相比，呈现了 983. 59%的变化，但手术24小时、72小时及168小时之后开始，在将lmg/kg的米罗那非进 行给药的实验组中，与神经细胞凋亡对照组相比，呈现了 -53. 92%、-39. 72%及-15. 68% 的变化。
[0237] 通过上述结果，可确认到米罗那非之类的5型磷酸二酯酶抑制剂抑制脑神经细胞 的凋亡来呈现神经细胞的保护活性。
[0238]【2.抑制神经细胞凋亡来呈现神经细胞的保护效果的5型磷酸二酯酶抑制剂所产 生的神经学及认知运动行为障碍的改善效果】
[0239] 【（1)体重变化】
[0240] 在神经细胞凋亡对照组中，从手术7天之后开始观察与假手术对照组相比更具有 显著性的（P< 0. 01或P< 0. 05)体重的减少，实验期间内的增体量也呈现了具有显著性 的（P< 0. 01)减少。从手术24小时及72小时之后开始，在将lmg/kg的米罗那非进行给 药的实验组中，分别在手术28天及29天确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性 的（P< 0. 01或p< 0. 05)体重的增加，实验期间的增体量也呈现了与神经细胞凋亡对照 组相比更具有显著性的（P< 0.01)增加。另一方面，手术168小时之后开始，在将lmg/ kg的米罗那非进行给药的实验组中，未确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的 体重及增体量的变化（表10及图4)。手术29天期间的增体量在神经细胞凋亡对照组中， 与假手术对照组相比，呈现了 -48. 49%的变化，但手术24小时、72小时及168小时之后开 始，在将lmg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，与神经细胞凋亡对照组相比，分别呈现 了 43. 24%、33. 78%及 11. 04%的变化。
[0241]【表10】
[0242]
[0243] 【⑵对感觉运动功能产生的影响分析】
[0244] 【前肢放置评价】
[0245] 仅选择使用了手术24小时之后在前肢放置检查中呈现最高点（score12)的大 鼠，在神经细胞凋亡对照组中，在手术28天之后也确认到与假手术对照组相比更具有显著 性的（P< 0. 01)前肢放置检查分数的增加。手术24小时及72小时之后开始，在将lmg/ kg的米罗那非进行给药的实验组中，手术28天后分别确认到与神经细胞凋亡对照组相比 更具有显著性的（P< 0. 01)前肢放置检查的减少，但手术168小时之后，在将lmg/kg的米 罗那非进行给药的实验组中，未确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的前肢放 置检查分数的变化（图5)。
[0246] 具体地，手术28天之后前肢放置检查分数在神经细胞凋亡对照组中与假手 术对照组相比呈现了 800. 00 %的变化，但手术24小时、72小时及168小时之后开始， 在将lmg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，与神经细胞凋亡对照组相比，分别呈现 了 -57. 41 %、-29. 63%及-11. 11 %的变化。
[0247]【后肢放置评价】
[0248] 仅选择使用了手术24小时之后在后肢放置检查中呈现最高点（score 6)的大鼠， 在神经细胞凋亡对照组中，在手术28天之后也确认到与假手术对照组相比更具有显著性 的（P < 0. 01)后肢放置检查分数的增加，但在手术24小时及72小时之后开始，在将lmg/ kg的米罗那非进行给药的实验组中，分别确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性 的（P < 0. 01)后肢放置检查的减少。手术168小时之后开始，在将lmg/kg的米罗那非进 行给药的实验组中，未确认到与神经细胞凋亡对照组相比更具有显著性的后肢放置检查分 数的变化（图6)。
[0249] 具体地，手术28天之后后肢放置检查分数在神经细胞凋亡对照组中与假手术 对照组相比呈现了 1050. 00 %的变化，但手术24小时、72小时及168小时之后开始， 在将lmg/kg的米罗那非进行给药的实验组中，与神经细胞凋亡对照组相比，分别呈现 了 -65. 22%、-3