2)。
[0105] 在抗湿腔室中，在常温条件下，与正常马血清阻断剂（Vector Lab. Inc.美国；稀 释1:100) -同将各个部分培养1小时，并用0. 01M的磷酸盐缓冲液清洗3分钟。
[0106] 在抗湿腔室中，在4°C温度下，与第一抗血清（抗劈胱天蛋白酶_3(Aspl75)多克 隆抗体（Anti-cleaved caspase_3(Aspl75)polyclonal antibody))，稀释 1:400;抗劈聚 (腺苷二磷酸-核糖）聚合酶（Asp214)大鼠特异性抗体（Anti-cleaved PARP(Asp214) rat specific antibody)，稀释1:100) -同将各个部分培养一宿之后，用0.01M的磷酸盐缓冲 液清洗3分钟。
[0107] 在抗湿腔室中，在常温条件下，与生物素化通用第二抗体（Vector Lab. Inc.美国； 稀释1:50) -同将各个部分培养1小时之后，用0. 01M的磷酸盐缓冲液清洗3分钟。
[0108] 在抗湿腔室中，在常温条件下，与亲和素-生物素-过氧化物酶复合物试剂 (Vectastain Elite ABC Kit，Vector Lab?稀释1:50) -同将各个部分培养1小时之后， 用0. 01M的磷酸盐缓冲液清洗3分钟。
[0109] 在过氧化物酶底物试剂盒（Vector Lab.)中，在常温条件下，将各个部分培养5分 钟之后，在0. 01M的磷酸盐缓冲液中清洗3分钟。
[0110] 用迈尔氏（Mayer' S)苏木精溶液进行对比染色之后，在流水中清洗30分钟。
[0111] 用95 %的乙醇进行2分钟的脱水、用100 %的乙醇进行3分钟的脱水之后，用二甲 苯进行2次透明化作业，并
[0112] 利用永久封固剂（permanent mounting medium)实现盖玻片之后，利用光学显微 镜进行观察（尼康，日本）。
[0113] 组织形态测定：将对胱天蛋白酶_3及聚（腺苷二磷酸-核糖）聚合酶（PARP，Poly ADP ribose polymerase)以10%以上的免疫反应性填满的神经细胞视为免疫反应性。使 用图像分析程序来测定了存在于同侧性损伤周边部位的大脑皮质的_ 2中的胱天蛋白酶-3 及聚（腺苷二磷酸-核糖）聚合酶免疫反应性细胞的数量。
[0114] 【5?组织病理学评价】
[0115] 上述神经细胞凋亡处置29天之后，牺牲了大鼠。去除脑部，并用磷酸盐缓冲 液（pH7. 4)来清洗之后，利用大脑不锈钢冠状矩阵（brain stainless steel coronal matrix ;Harvard，美国）来从额叶极（frontal brain pole)开始以2至14mm的范围分为 连续的6个冠状切面（厚度为2mm)。将利用大脑不锈钢冠状矩阵来制备的脑部固定于10% 的中性缓冲福尔马林（NBF，neutral buffered formalin)(未进行TTC染色）。之后，为了 大脑皮质的组织病理学检查，实施苏木精和伊红（H&E，hematoxylin and eosin)染色。在 苏木精和伊红染色条件下，通过组织形态测定术（Histomorphometry)计算了大脑皮质的 萎缩性％ (cerebral atrophic% )及退行性神经元（degenerative neurons，呈现为嗜酸 性粒细胞）的数量。为了分析，未向组织病理学者提供组的编采的信息。
[0116] 组织形态测定：与制备的组织染色标本的完整的对侧性（contralateral)半球进 行比较，并按照以下数学公式1计算了同侧性（ipsilateral)大脑皮质的萎缩％。并且，测 定了每单位面积（_ 2)的退行性神经元的数量。
[0117]【数学公式1】
[0118] 形成脑萎缩=(对侧性大脑皮质的面积一同侧性大脑皮质的面积）/对侧性大脑 皮质面积X 100
[0119] 【6?体重测定】
[0120] 诱发神经细胞凋亡1天前、诱发当天及诱发之后1天、7天、14天、21天、28天及29 天测定了体重。为了减小各个动物之间的差异，按照以下数学公式2计算了诱发之后体重 的增加量和连续性的试验物质的给药。
[0121] 【数学公式2】
[0122] 诱发神经细胞凋亡之后29天期间的体重增加量=(诱发神经细胞凋亡29天之后 的体重一神经细胞凋亡诱发各天的体重）
[0123]【7?感觉运动功能评价（sensorimotor function assessment) -神经学运动行为 检查】
[0124]利用肢体放置检查（limb placing test ;de Ryck M et al.，Stroke. 20:1383-90 (1989))及身体摇摆检查（body swing ;Borlongan and Sanberg，J Neurosci. 15:5372-8(1995))来评价了感觉运动功能。为了取得基准，在诱发神经细胞凋亡 1天之前执行检查之后，诱发第1天、第3天、第7天、第14天、第21天、第28天执行。行为 检查在将药物进行给药之前结束。未向负责评价的检查员提供实验物质处理的信息。
[0125] 肢体放置检查：独立评价了前肢及后肢的放置。为了前肢放置检查，使大鼠的前 肢处于自由的状态，抓住躯干慢慢地向桌子上端的边缘移动，停止对大鼠胡须的短的触摸 (用于视觉所诱导的放置），触摸大鼠的胡须（用于胡须所诱导的放置），直到上述桌子上端 的边缘向前肢的前面照射光（用于触觉所诱导的放置），借助所增加的压力向桌子的边缘 伸出前肢（用于本体感受所诱导的放置）。按照上述方法评价了后肢放置。按照以下的基 准对视觉、胡须、触觉及本体感受刺激的各个肢体的反应进行了评分化（在前肢试验中总 分为12分，在后肢试验中6分意味着最大神经缺损，0分意味着正常行为）。
[0126] 正常行为=〇分；
[0127]单侧肢体表现（performance with unilateral limb) = 1 分；
[0128] 延迟（2秒钟）和/或不完全行为=2分；
[0129] 无行为=3分。
[0130] 身体摇摆检查：从尾端约2cm的位置抓住实验动物之后，向桌子表面上以1英寸的 方式进行增加。每当大鼠将头部从垂直轴移动10°以上之后重新回到垂直姿势时，记录了 摇摆（swing)。对每只动物计算了共30次的摇摆。由于向右半球诱发神经细胞凋亡之后， 实验动物存在向相反的脑（左侧）侧摇摆的倾向，因而作为恢复率的测定，与完整动物的分 数记录一同记录了向右侧的摇摆数及百分比。
[0131] 【8?认知运动行为评价（cognitive motor behavior assessment)】
[0132]为了认知检查，实施了水迷宫检查（J Neurosci Methods. 11:47-60(1984))。神 经细胞凋亡诱发14天及28天之后，在填满22. 0±1. 0°C温度的水的暗颜色的罐（直径 150cmX高度50cm)中，以隔10分钟的方式实施了 3次。将15X30cm的水中平台（从水的 表面2mm以下）放置于水槽的西北象限（northwest quadrant)。使释放点（release point) 始终朝向水槽的南侧。以与水槽的壁相向的方式使实验动物入水之后进行释放。利用摄像 机跟踪系统（Smart junior，PanLab，西班牙）来对各实施中的实验动物的游泳路径进行了 记录，并计算了到达逃避平台（escape platform)为止移动的距离（m)及时间（秒钟）。
[0133] 【9?统计分析】
[0134] 所有数据都由10只大鼠的平均值土标准差（S.D.)表示。执行了用于服用量 不同的组的多重比较检查。利用Levene试验（Levene A, Clin Otalary, 1981;6:145-51) 来调查了方差齐性（Variance homogeneity)。若Levene试验结果为从方差齐性导出无 显著性的偏差的情况下，为了确定组比较的哪一对组显著不同，根据单向方差分析试验 (one-way AN0VA test)之后的最小显著差异（LSD)多重比较试验来分析了得到的数据。 并且，在Levene试验中观察到从方差齐性具有显著性的偏差的情况下，执行了非参数比较 试验（non-parametric comparison test)及克鲁斯凯-沃里斯试验（Kruskal-Wallis H test)。在克鲁斯凯-沃里斯试验中观察到具有显著性的差异的情况下，为了确定呈现显著 不同的差异的特定组对，执行了 Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W test。统计学分析 使用统计产品与服务解决方案（SPSS) (Release 14K，SPSS Inc.，USA ;Ludbrook，Clin Exp Pharmacol Physiol，1997;24:294-6)来执行。并且，为了对试验物质的效率的理解，根据 以下数学公式3计算了神经细胞凋亡对照组和米罗那非处理实验组之间的变化。
[0135]【数学公式3】
[0136] 与神经细胞凋亡对照组进行比较的百分比变化（％ ) = [((米罗那非处理组的数 据一神经细胞凋亡对照组的数据）/神经细胞凋亡对照组的数据）X 100]
[0137]【实验结果】
[0138] 【1. 5型磷酸二酯酶抑制剂的神经细胞凋亡抑制效果】
[0139] 在受损伤的脑组织周边部位的病理学标本中，在神经细胞凋亡对照组中，确认到 作为比假手术对照组更损伤的部位的右侧大脑半球的具有显著性的显著萎缩和在每单位 面积（_2)大脑皮质内的退行性神经元、胱天蛋白酶-3及聚（腺苷二磷酸-核糖）聚合酶 免疫反应细胞的数量增加。相反，在0. 5mg/kg的米罗那非给药组中，分别确认到与对照组 相比更具有显著性的大脑皮质内的退行性神经元、胱天蛋白酶-3及聚（腺苷二磷酸-核 糖）聚合酶免疫反应细胞的数量减少。在lmg/kg及2mg/kg的米罗那非给药组中，确认到 与对照组相比更具有显著性的大脑皮质的萎缩抑制（P < 0. 01)，大脑皮质内的退行性神经 元、胱天蛋白酶-3及聚（腺苷二磷酸-核糖）聚合酶免疫反应细胞的数量也呈现了具有显 著性的减少（P<〇.01;表2及图1)。
[0140]【表2】
[0141]
[0142] 具体地，在0?5mg/kg、lmg/kg及2mg/kg的米罗那非给药组中，作为损伤部位的石 侧大脑半球的萎缩程度与对照组相比，分别呈现了 -8. 70%、-46. 42%及-53. 31%的变化。
[0143] 在0.5mg/kg、lmg/kg及2mg/kg的米罗那非给药组中，作为损伤部位的右侧大脑 皮质中，每单位面积的退行性神经元的数量与对照组相比，分别呈现了 -44. 47%、-73. 46% 及-76. 54 %的变化。
[0144] 在0?5mg/kg、lmg/kg及2mg/kg的米罗那非给药组中，作为损伤部位的右侧大 脑皮质中，每单位面积的胱天蛋白酶-3免疫反应神经元的数量与对照组相比，分别呈现 了 -33. 43 %、-76. 44 % 及-77. 96 % 的变化。
[0145] 在0.5mg/kg、lmg/kg及2mg/kg的米罗那非给药组中，作为损伤部位的右侧大脑皮 质中，每单位面积的聚（腺苷二磷酸-核糖）聚合酶免疫反应神经元的数量与对照组相比， 分别呈现了 -37. 58%、-76. 74 %及-78. 32 %的变化。
[0146] 通过上述结果，可以确认到米罗那非之类的5型磷酸二酯酶抑制剂通过抑制脑神 经细胞的凋亡呈现神经细胞的保护活性。
[0147] 【2.抑制神经细胞凋亡来呈现神经细胞的保护效果的5型磷酸二酯酶抑制剂所产 生的神经学及认知运动行为障碍的改善效果】
[0148]【⑴体重变化】
[0149] 在神经细胞凋亡对照组中，从手术14天之后开始观察与假手术对照组相比更具 有显著性的体重的减少（P< 0. 01或P< 0. 05)，实验期间内的增体量也呈现了具有显著性 的减少（P< 〇. 01)。在lmg/kg及2mg/kg的米罗那非给药组中分别观察到与神经细胞凋亡 对照组相比更具有显著性的增体量的增加（P< 0. 01)，在0. 5mg/kg的米罗那非给药组中也 观察到与对照组相比更显著的增体量的增加（表3及图2)。神经细胞凋亡（大脑右半球损 伤）诱发之后29天期间的增体量在0. 5mg/kg、lmg/kg及2mg/kg的米罗那非给药组中，与 对照组相比分别呈现了 45. 53%、218. 52%及155. 74%的变化。
[0150] 【表3】
[0151]
[0152] 【（2)对感觉运动功能产生的影响分析】
[0153]【前肢放置评价】
[0154] 在神经细胞损伤（大脑右半球损伤）对照组中，从手术24小时之后开始在整个实 验期间观察到与假手术对照组相比更具有显著性的前肢放置检查分数的增加（P< 〇. 01)。 在0. 5mg/