用作葡萄糖－6－磷酸移位酶抑制剂的芳族二酮基衍生物的制作方法

专利名称：用作葡萄糖－6－磷酸移位酶抑制剂的芳族二酮基衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新颖的芳族二酮基衍生物和它们的药学上可接受的盐、酯、醚和其他明显的化学等价物。这些衍生物是葡萄糖-6-磷酸移位酶抑制剂，能够用于糖尿病的治疗。本发明进一步涉及这些衍生物的制备方法，涉及这些衍生物和它们的药学上可接受的盐、酯、醚和其他明显的化学等价物作为药物的用途，特别是它们在糖尿病治疗中的用途，还涉及包含这些衍生物、其药学上可接受的盐、酯、醚或其他明显的化学等价物的药物组合物。
肝糖输出率增加是糖尿病的普遍特征。特别是在非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)中禁食血浆葡萄糖水平与肝糖输出之间存在密切的相互关系。肝内产生葡萄糖的两种途径是糖异生和糖原分解。两种途径的末端步骤都受微粒体葡萄糖-6-磷酸酶的催化，它是血糖水平的稳态调节中的关键酶。还已知这种酶的水平在糖尿病的实验与病理条件中都升高。对这种酶系统进行干涉因此应当导致肝糖产生减少。
肝葡萄糖-6-磷酸酶是多组分系统，由至少三种功能活性组成葡萄糖-6-磷酸移位酶(T1)、葡萄糖-6-磷酸磷酸水解酶和磷酸/焦磷酸移位酶(T2)。葡萄糖-6-磷酸移位酶有利于葡萄糖-6-磷酸转运至内质网(ER)的腔内。活性部位位于ER腔表面的磷酸水解酶水解葡萄糖-6-磷酸，向腔内释放葡萄糖和磷酸盐。磷酸/焦磷酸移位酶有利于磷酸盐的流出，不过葡萄糖流出的精确机理尚不清楚。
葡萄糖-6-磷酸移位酶的高度底物特异性使其成为潜在的糖尿病治疗中的药理学介入目标。因而，在生理学上已有的糖磷酸酯中，只有葡萄糖-6-磷酸是被移位酶转运的。相形之下，磷酸酶是非特异性的，已知水解各种有机磷酸酯。
文献已经描述了葡萄糖-6-磷酸酶的一系列非特异性抑制剂，例如根皮苷(J.Biol.Chem.(生物化学杂志)242，1955-1960(1967))、5，5’-二硫代-双-2-硝基苯甲酸(Biochem.Biophys.Res.Commun.(生物化学与生物物理学研究通讯)48，694-699(1972))、2，2’-二异硫氰酸根合茋和2-异硫氰酸根合-2’-乙酰氧基茋(J.Biol.Chem.(生物化学杂志)255，1113-1119(1980))。EP-A-587 087和EP-A-587 088提出了第一种治疗学上可利用的葡萄糖-6-磷酸酶系统的抑制剂。PCT/EP 98/02247所述Kodaistatins A、B、C和D是第一种来自微生物来源的葡萄糖-6-磷酸移位酶抑制剂。
根据本发明的芳族二酮基衍生物可以从名为mumbaistatin的化合物衍生而来。PCT/EP 99/04127描述了mumbaistatin。它是可通过微生物石蕊杀菌素链霉菌(Streptomyces litmocidini)培养而获得的天然产物，其样本已于1997年7月4日保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ)，入藏号DSM 11641。现已测定了mumbaistatin的结构式如下 已经发现，某些mumbaistatin衍生物比mumbaistatin本身具有更高的活性，并且更好地为哺乳动物机体所耐受。而且，所分离的mumbaistatin非对映体优于mumbaistatin非对映体混合物。
本发明因此提供通式I化合物 其中R4、R5、R6和R7独立地是H、OH、卤素、可选被取代的烷基、芳基或酰基、X-烷基或X-芳基，其中的X是O、NH、N-烷基或S，K是下式II或III基团 L是下式IV或V基团 或者K和L与它们所键合的各个碳原子一起构成下式VI、VII或VIII基团 其中R1和R3独立地是阳离子、H、烷基或芳基，R2是H、烷基、芳基或酰基，X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7独立地是O、NH、N-烷基或S，cyclus环与标记为“c”和“d”的C原子一起是可选被取代的饱和、部分不饱和或芳族、碳环或杂环、单一或稠合环系，排除这样的化合物，其中的K是式II基团，L是式IV基团，其中的X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7是O，R1、R2和R3是H，R4是OH，R5、R6和R7是H，cyclus是3，8-二羟基蒽醌，和这样的化合物，其中的K和L一起构成式VI基团，其中的X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7是O，R1是CH3，R2和R3是H，R4是OH，R5、R6和R7是H，cyclus是3，8-二羟基蒽醌，及其药学上可接受的盐、酯和醚和其他明显的化学等价物，所有它们的立体异构与互变异构形式及其任意比例的混合物。
本发明进而包括通式IX化合物 其中M是式X基团 N是式XI基团-X5R3XI或者M和N与它们所键合的C原子一起构成式XII残基 它是通过标记为“e”的C原子键合的，O是式XIII基团 P是式XIV基团-X5R2XIV或者O和P与它们所键合的C原子一起构成式XV残基 它是通过标记为“f”的C原子键合的，其中的R1至R7、X1至X7、cyclus、c和d是如权利要求1所定义的，及其药学上可接受的盐、酯和醚和其他明显的化学等价物，所有它们的立体异构与互变异构形式及其任意比例的混合物。
本文所用的术语“烷基”代表可选被取代的直链或支链C1-C6-烷基，优选为C1-C4-烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基或异丁基；可选被取代的直链或支链C2-C6-烯基，优选为C2-C4-烯基，例如烯丙基；可选被取代的直链或支链C2-C6-炔基，优选为C2-C4-炔基，例如丙炔基。
本文所用的术语“芳基”代表可选被取代的苄基或苯基。
本文所用的术语“酰基”代表可选被取代的脂族、芳族或杂环酰基，例如C1-C4-脂族酰基，例如乙酰基或丙酰基；芳族酰基，例如苯甲酰基或甲苯甲酰基；和杂环酰基，它是从具有1-4个杂原子的5-或6-元环衍生的，例如烟酰基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基和噁唑基。
本文所用的“可选被取代”表示有关基团可选地被一个或多个、优选为1、2、3或4个相同或不同的取代基取代，取代基选自羟基、C1-C4-烷基、C1-C4-烯基、C1-C4-烷氧基、C1-C4-烷硫基、C1-C4-烷氧羰基、氨基甲酰基、羧基、三氟甲基、氰基、硝基、氨基、C1-C4-烷基氨基、二C1-C4-烷基氨基、脒基、芳氧基、芳基氨基和卤素。
卤素代表I、Br、Cl或F，优选为Cl或Br。
术语“阳离子”代表无机金属离子或有机铵离子。可以提到的实例特别是药理学上可接受的碱金属离子或碱土金属离子，优选为钠、钾、钙或镁离子，铵离子，有机铵离子、特别是可选被取代的烷基化铵离子，例如三乙铵或二乙醇铵离子，以及吗啉、苄基铵、普鲁卡因、L-精氨酸和L-赖氨酸离子。
用在各结构式中的包括标记为“c”和“d”的碳原子在内的cyclus环可以代表可选被取代的饱和、部分不饱和或芳族、碳环或杂环、单一或稠合环系。单一环系表示含有3至6个环原子的单环，稠合环系表示含有6至14个环原子的稠合二环或三环。
饱和碳环环系可以代表3至14元环系，优选为单一的3至8元环，例如环-C3-C8-烷基，更优选为环-C3-C6-烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基。它还可以代表二环或三环的稠合环系，例如二环并[3.3.1]壬烷和十四氢菲。
部分不饱和碳环环系不同于饱和碳环环系之处在于具有一条或两条双键或叁键。因而它可以代表3至14元环系，优选为3至8元环，例如环-C3-C8-烯，例如环戊二烯或环辛四烯，更优选为环-C3-C6-烯或环-C5-C8-炔。
单一或稠合的芳族碳环环系可以代表5至14元单环、二环或三环环系，例如苯基、萘基、菲或蒽醌。
杂环环系可以是饱和、部分不饱和或芳族的，可以是如上所定义的单一或稠合环系。杂环环系代表如上所定义的碳环环系，其中的1、2、3或4个C原子被相同或不同的选自N、O和S的杂原子所代替。它例如可以代表5-或6-元环，具有1至4个选自N、S和N的杂原子，特别是N，可选地与S或O一起作为环原子。一些杂环环系的实例是杂烷基，例如吡咯烷、哌啶、四氢呋喃、噁唑烷和噻唑烷；杂芳基残基，例如吡啶基、嘧啶基、呋喃基、苯并噻唑基、苯并呋喃基和吲哚基。
优选地，cyclus环是式XVI基团 其中R8是H、烷基、芳基或酰基，R9是阳离子、H、烷基、芳基或酰基，R10、R11、R12和R13独立地是H、烷基、-X10H或-X10R，或者R10与R11和/或R12与R13一起是＝X10，X8、X9和X10独立地是O、NH或N-烷基或S，R是烷基、芳基或酰基，……是可选的键，cyclus是通过标记为“c”和“d”的C原子键合的。
更优选地，cyclus环是式XVIA残基 其中X8和X9独立地是H或O，R8和R9独立地是H或烷基，R10至R13是H，或者R10与R13一起和/或R12与R13一起是＝O，cyclus是通过标记为“c”和“d”的C原子键合的。
该结构的cyclus部分可以是各种不同环结构的任意一种。不过有利的是在cyclus上具有取代，优选为羟基或烷氧基。cyclus优选为下式XVIB的芳环结构 其中R9是H或C1-C4-烷基，X9是O。
优选的本发明化合物具有下列通式XVIII 其中R1至R7、X1至X7、cyclus、c和d是如上所定义的，排除这样的化合物其中的X1至X7是O，R1、R2和R3是H，R4是OH，R5、R6和R7是H，cyclus是3，8-二羟基蒽醌，及其药学上可接受的盐、酯和醚和其他明显的化学等价物，所有它们的立体异构与互变异构形式及其任意比例的混合物。
优选地，标记为星号的碳具有S构型，在这种情况下不适用上述例外排除。
适合地，R1、R2和R3是C1-C6-烷基，优选为C1-C4-烷基，例如甲基。
适宜地，任意一个或多个X1至X7是O。
上式XVIII化合物的实例如下 上式XVIIIB化合物的进一步实例如下 式XVIIIA和式XVIIIB的烷基化mumbaistatin衍生物是这样获得的将mumbaistatin溶于溶剂，优选为有机溶剂，例如链烷醇，如甲醇，再与烷基化剂反应，例如重氮烷，如重氮甲烷、重氮乙烷，或二芳基甲基重氮甲烷，如二苯基重氮甲烷。上述式XVIIIA和式XVIIIB化合物中的烷基取代基优选为C1-C4-烷基。若C1-C4-烷基是甲基，则甲基化mumbaistatin衍生物例如可以是这样获得的，mumbaistatin在溶液中与甲基化剂，例如重氮甲烷反应。
mumbaistatin理想地预先已用酸处理，优选为小分子有机酸，例如甲酸、乙酸或三氟乙酸。随后优选地通过色谱法分离反应产物。
从反应介质中分离根据本发明的化合物的方法可以是本身已知的，取决于所得化合物的溶解度。
式XVIII化合物的进一步实例是下列非对映体 其中标记为星号的C原子具有S构型。
根据本发明的式XVIIID非对映体如下所示 其中标记为“a”和“b”的半缩酮(half-ketal)或缩酮形式的碳原子，独立地具有S或R构型。
式XVIII化合物的进一步实例如下
上述例证的有些优选的式I化合物可以通称为羟基-二酮基-二碳酸(hydroxy-diketo-dicarbonic acid)衍生物。
本发明进一步涉及下列通式XIX化合物 其中R1至R7、X1至X7、cyclus、c和d是如上所定义的，排除这样的化合物其中的R1是甲基，R4是-OH，X1至X7是O，cyclus是3，8-二羟基蒽醌，及其药学上可接受的盐、酯和醚和其他明显的化学等价物，包括所有它们的立体异构与互变异构形式及其任意比例的混合物。
优选地，R1是C1-C6-烷基，例如甲基。R4适合地是羟基或C1-C6-烷氧基，例如甲氧基。
式XIX化合物的实例如下 式XIX化合物的进一步实例如下
式XIX化合物的更进一步实例如下 式XIX化合物的另一个实例是下列非对映体 其中标记为星号*的C原子具有S构型，分别标记为“a”和“b”的C原子都具有S或R构型。
式XIXA、XIXB或XIXC化合物的一种制备方法包含将mumbaistatin溶于溶剂，优选为有机溶剂，例如链烷醇，如甲醇，再与甲基化剂反应，例如重氮甲烷。mumbaistatin理想地预先已用酸处理，例如三氟乙酸。随后优选地通过色谱法分离反应产物。
mumbaistatin在pH约6至9的溶液中的稳定性有限。在酸性pH下，mumbaistatin迅速经历复杂的转化，例如转化为上式XIXD化合物。因为mumbaistatin的酸形式与重氮甲烷反应生成上式XVIIIA、XVIIIB、XIXA、XIXB和XIXC甲基化化合物，所以需要加以特别小心，以确保得到自然的、确定的甲基化产物。已经发现所需的甲基化产物是在冷却条件下得到的，例如-1℃至3℃的温度，优选为0℃，和/或是在反应时间不长的情况下得到的。惊人的是可以利用水与乙腈的混合物结晶至少这样的一种甲基化产物。这使通过X放射光谱测定法测定化合物的结构成为可能。表1三甲基-mumbaistatin(式XVIIIA)的晶体数据和结构精修鉴别代码 sh608经验式 C33H27NO11分子量 613.56温度 293(2)K波长 0.71073晶体系统 Monoclinic空间群 P2(1)晶胞尺寸 a＝12.907(4) α＝90°.
b＝11.253(5) β＝96.56(2)°.
c＝20.003(6) γ＝90°体积 2886.2(17)3Z4密度(计算值) 1.412Mg/m3吸收系数 0.107mm-1F(000) 1280晶体大小 0.04×0.1×0.2mm3数据采集的θ范围 2.08 to 20.83°.指数范围 -12＜＝h＜＝12，-11＜＝k＜＝11，-19＜＝l＜＝19所收集的反射 9796独立反射 5833[R(int)＝0.0447]对θ＝20.83°的完整性98.7％吸收校正 最大0.862，最小0.632求精方法 根据F2的全矩阵最小平方数据/限制/参数 5833/1/822根据F2的拟合优度1.064最终的R指数[1＞2σ(1)] R1＝0.0510，wR2＝0.0966R指数(所有数据) R1＝0.0981，wR2＝0.1171绝对结构参数 1(2)消光系数 0.0035(4)最大扩散峰和孔 0.194和-0.174e.-3
表2四甲基mumbaistatin内酯二螺酮的化学位移(式XIXC，CDCl3，280K)
a)A和B相当于两种非对映体形式(A∶B之比大约1.2∶1.0)表3式XVIIIA与式XVIIIB的芳族质子对比
表4mumbaistatin内酯-二-螺缩酮-单甲基酯(式XIXA，DMSO，300K)的化学位移
a)在13C-光谱中没有观察到关于这些核的信号若观察到两组信号(比例大约1.1∶1.0)，则它们相当于两种非对映体形式。在这些非对映体显示不同的化学位移的情况下，两个数值用逗号隔开(第一个数值相当于主要组分)。
本发明还涉及通式XX化合物 其中R1至R7、X1至X7、cyclus、c和d是如上所定义的，及其药学上可接受的盐、酯和醚和其他明显的化学等价物，所有它们的立体异构与互变异构形式及其任意比例的混合物。
优选地，X1至X7一个或多个是O。
本发明此外涉及通式XXI化合物 其中R1至R7、X1至X7、cyclus、c和d是如上所定义的，及其药学上可接受的盐、酯和醚和其他明显的化学等价物，所有它们的立体异构与互变异构形式及其任意比例的混合物。
优选地，X1至X7中一个或多个是O。
本发明另外涉及通式XXII化合物 其中R1至R7、X1至X7、cyclus、c和d是如上所定义的，及其药学上可接受的盐、酯和醚和其他明显的化学等价物，所有它们的立体异构与互变异构形式及其任意比例的混合物。
优选地，X1至X7中一个或多个是O。
式XXII化合物的实例如下 式XXIIA化合物的制备方法包含将mumbaistatin溶于溶剂，优选为有机溶剂，例如链烷醇，再与酰胺源反应，例如氨溶液。该方法是在冷却条件下进行的，优选为-1℃至3℃的温度下，更优选为0℃。随后分离反应产物。
本发明此外涉及通式XXIV化合物 其中R1至R7、X1至X7、cyclus、c和d是如上所定义的，及其药学上可接受的盐、酯和醚和其他明显的化学等价物，所有它们的立体异构与互变异构形式及其任意比例的混合物。
优选地，X1至X7中一个或多个是O。
根据本发明的化合物是互变异构体，其中开放形式和封闭形式是平衡存在的。
通过与适合的碱反应，上述式XIX至XXIV的封闭结构可以转化为式XVIII的开放结构。适合用于该反应的碱是无机或有机碱。因而，可以使用叔胺和碱金属碳酸盐，后者例如碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾、碳酸锂。
根据本发明的互变异构体平衡是如下式XXIIIA和XVIIIF化合物
根据本发明的化合物可以转化为药学上可接受的盐和明显的化学等价物，象酯和醚，它们均为本发明所覆盖。本发明还涵盖本发明这样一些化合物的所有的盐和明显的化学等价物，它们本身不适合用作药物，但是它们可以作为中间体，用于药学上可接受的盐和衍生物的制备。本发明覆盖这些芳族二酮基衍生物和它们的盐、酯、醚和其他明显的化学等价物，包括它们的所有立体异构形式和互变异构形式。通过本领域技术人员已知的标准程序可以制备衍生物的盐(例如Na、K、铵盐)。象钠与钾盐等盐例如可以这样制备，即将这些化合物用适合的钠或钾碱处理。
酯可以这样制备例如，在例如二环己基碳二亚胺(DCC)这样的试剂的存在下，使这些化合物与羧酸反应，或者将化合物用酰化剂，例如酰氯处理。酯的其他制备方法参见文献，例如J.March，AdvancedOrganic Synthesis(有机合成进展)，第4版，John Wiley & Sons，1992。
醚可以这样制备，例如在碱性条件下，使mumbaistatin与烷基化剂反应。醚的其他制备方法参见文献，例如J.March，AdvancedOrganic Synthesis(有机合成进展)，第4版，John Wiley & Sons，1992。
其他明显化学等价物包括还原或氧化产物和加成产物，例如水合物。例如，mumbaistatin的蒽醌基可以被还原剂还原为氢醌。所得产物是葡萄糖-6-磷酸移位酶的有效抑制剂，IC50＝～5nM。
在若干关于mumbaistatin的生物化学试验系统中都已经显示出葡萄糖-6-磷酸移位酶活性。不过，石蕊杀菌素链霉菌培养物滤液的mumbaistatin收率极低，这妨碍了化合物的进一步开发。而且，迄今还没有可能确定mumbaistatin的结构式，原因是多方面的，包括化合物不能结晶和在溶液中的不稳定性。
不过现在已经发现有一种方法能够以相对高的收率从提取物中分离mumbaistatin。本发明因此提供mumbaistatin的分离方法，包含在pH 5-8、优选为6或7下，通过离子交换色谱法提取包括mumbaistatin的培养物滤液。尽管PCT/EP 99/04127提到了离子交换的使用，不过显然尚未认识到可出于提高收率的目的而使用离子交换。这是从上述专利申请PCT/EP 99/04127中的实施例看出来的，其中的离子交换器不是用于mumbaistatin的分离，并且从730升培养物滤液仅得到70mg纯的mumbaistatin。本发明的方法借助离子交换的方法可以实现mumbaistatin和与之有关的化合物的分离和富集，所得收率至少在50％以上，更通常为＞70％。按照本发明所得mumbaistatin与PCT/EP 99/04127所得mumbaistatin相比，IC50降低至～5nM。
在根据本发明的mumbaistatin分离方法中，可以使用各种离子交换器。实例是QAE-、DEAE-和THAE-阴离子交换器。优选地，在所选择的基质上携带取代或未取代的氨基。更优选地，使用DEAE-阴离子交换器，例如DEAE-Sepharose Fast Flow或Fractogel EMD DEAE。可以按照已知方式使用阴离子交换器。在缓冲系统中可以使用5至85％的有机溶剂。不过优选的是所用有机溶剂在缓冲系统中的含量高，因此优选地使用在水性缓冲溶液中含量为10至40％的有机溶剂。适合的有机溶剂实例是水可混溶性有机溶剂，例如低级醇、丙酮、乙腈、乙二醇、二噁烷、二甲基亚砜、甲酰胺等。优选的溶剂是甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮。
利用所述方法，可以得到纯度＞99％的mumbaistatin，该化合物的收率可以在70％以上。所得富集的mumbaistatin可以按照简单方式加以纯化，例如分子筛和/或反相色谱法。
根据本发明的化合物可抑制大鼠肝微粒体葡萄糖-6-磷酸移位酶。这些化合物因此可用作药学上的活性成分，特别是用于糖尿病的治疗，更普遍地用于这样的病症的治疗或预防，它们是由葡萄糖-6-磷酸移位酶活性升高所导致的或与之有关，或者希望减少葡萄糖-6-磷酸移位酶活性的状况。根据本发明的化合物及其药学上可接受的盐、酯、醚和其他明显的化学等价物可以作为药物对动物给药，优选为哺乳动物，特别是人，药物可以是它们本身、彼此的混合物和药物组合物的形式，允许肠内或肠胃外给药。
因此，本发明还涉及用作药物的芳族二酮基衍生物及其药学上可接受的盐、酯、醚和其他明显的化学等价物，涉及这些衍生物及其药学上可接受的盐、酯、醚和其他明显的化学等价物的用途，用于制备减少葡萄糖-6-磷酸移位酶活性的药物，特别是用于制备治疗糖尿病的药物。本发明进一步涉及药物组合物，其含有有效量的这些衍生物和/或一种或多种其药学上可接受的盐、酯、醚和/或明显的化学等价物以及药学上可接受的载体。
根据本发明的化合物可以通过口服、肌内、静脉内或其他给药方式给药。单独或者组合含有这些化合物或其药学上可接受的盐或明显的化学等价物的药物组合物可以按照标准工艺加以制备，包括将化合物与一种或多种药理学上可接受的赋形剂和/或助剂混合，例如填充剂、乳化剂、润滑剂、矫味剂、着色剂或缓冲物质，再将混合物转化为适合的药物剂型，例如片剂、包衣片、胶囊剂或适合于肠内或肠胃外给药的悬液或溶液。
可以提到的助剂和/或赋形剂的实例是淀粉、黄蓍胶、乳糖、滑石、琼脂、多元醇、乙醇和水。适合和优选的肠胃外给药剂型是水悬液或水溶液。还有可能将活性物质以适合的剂型例如胶囊剂而没有载体或稀释剂进行给药。包含一种或多种这些化合物或药学上可接受的盐或明显的化学等价物的药物组合物还可以含有其他药学上的活性成分。
习惯上，盖仑制剂和给药方法以及适合于具体情况的剂量范围取决于所要治疗的物种和相应病症或疾病的状态，可以利用本领域已知的方法加以优化。一般来说，根据本发明的化合物的每日剂量对体重约75kg的患者来说是至少0.001mg，至多100mg，优选为至多10.0mg。
除了用作药学上的活性成分和衍生物制备中的中间体以外，这些化合物及其盐和明显的化学等价物还可以作为助剂，用于诊断目的，例如体外诊断，还可用于其中需要抑制葡萄糖-6-磷酸移位酶的生物化学研究目的。
下列实施例是本发明的例证，但不限制其范围。
缩写MeOH甲醇；DMSO二甲基亚砜；TFA三氟乙酸。
实施例1培养物石蕊杀菌素链霉菌DSM 11641的维持在下列培养基上维持培养物DSM 11641麦芽提取物10.0g酵母提取物4.0g葡萄糖4.0g琼脂粉13.0g软化水1.0升pH7.0加热彻底溶解上述成分后，分配在试管内，在121℃下灭菌20分钟。然后将试管冷却，呈倾斜位置固化。将琼脂斜面用线圈划线，使培养物石蕊杀菌素链霉菌DSM 11641生长其中，在28℃(±1℃)下培养直至观察到良好的生长。将生长良好的培养物贮存在8℃冰箱内。
实施例2培养物石蕊杀菌素链霉菌DSM 11641在发酵罐内发酵第1阶段在摇瓶内制备种子培养物种子培养基的组成葡萄糖15.0g大豆粗粉 15.0g玉米浆5.0gNaCl 5.0gCaCO32.0g软化水1.0升pH7.0将上述种子培养基按160ml分配在1L埃伦迈厄瓶内，在121℃下高压灭菌20分钟。将烧瓶冷却至室温，然后在每只烧瓶内接种一满环上述实施例1生长良好的培养物，在27℃(±1℃)和240rpm下，在旋转摇动器上摇动72小时，得到种子培养物。
生产培养基的组成葡萄糖 20.0g大豆粗粉 10.0gCaCO30.2g氯化钴 0.001g软化水 1.0升pH 7.0第2阶段在发酵罐内制备种子培养物在121℃下将80升上述种子培养基在100升Marubishi发酵罐内原位灭菌45分钟，冷却至27℃±1℃，接种4.5升上述种子培养物。
利用下列参数进行发酵温度 27℃(±0.5℃)搅拌 80rpm通气 501pm收获时间 24小时第3阶段大规模发酵在121℃下将700升上述生产培养基在1000升Marubishi发酵罐内与150mlDesmophen(聚氧丙烯)作为消泡剂一起原位灭菌45分钟，冷却至27℃±1℃，接种75升来自第2阶段的种子培养物。
利用下列参数进行发酵温度 27℃(±0.5℃)搅拌 50rpm换气 450lpm收获时间 40-44小时通过测量葡萄糖-6-磷酸移位酶的抑制作用，监测化合物的生产。当发酵中断时，培养肉汤的pH为6.0-7.0。收获后将培养肉汤离心，如下实施例3所述从培养物滤液分离葡萄糖-6-磷酸移位酶抑制剂mumbaistatin。
实施例3通过阴离子交换分离mumbaistatin
收获大约200升培养肉汤，通过离心与菌丝体(12kg)分离。发现所需化合物mumbaistatin主要存在于培养物滤液中。使培养物滤液(180升，含有120mg mumbaistatin)通过填充有吸附树脂MCI GELCHP20P的柱子(直径20cm×高45cm，容量14升)。将柱子用120升0.1％磷酸盐缓冲液pH 6.3至120升45％异丙醇水溶液的梯度洗脱。柱子流通量为18升/小时。最大量的mumbaistatin(12升中102mg)存在于不含盐的级分中，该级分是用25至28％异丙醇水溶液步进梯度洗脱的。使所得活性洗脱液通过DEAE-Sepharose Fast Flow填充柱(3升)，柱子已用磷酸盐缓冲液平衡至pH 7.0。洗脱mumbaistatin的梯度过程是含20％异丙醇的0.1％磷酸钠缓冲液pH 7.0作为A缓冲液和含20％异丙醇的0.1％磷酸盐缓冲液与0.25％NaCl作为B缓冲液。使用50ml/min流速，收集100个级分，其中第72至74级分含有81mg高度富集的mumbaistatin，第75级分含有另外不太纯的18mg。合并各级分，在真空中浓缩。通过Nucleosil 100-10 C18AB柱(2.1cm×25cm)进一步纯化，在pH 6.3下用含5-35％乙腈的0.05％乙酸铵缓冲液步进梯度洗脱。冷冻干燥纯级分，得到总共86mg(73+13mg)纯的mumbaistatin铵盐。
mumbaistatin的钠盐是这样制备的，将40mg铵盐溶于10ml水(pH6.4)，用氯化钠增加溶液的流动性至12mS/cm2。然后使所得水溶液通过MCI GEL CHP20P柱(宽1cm×高9cm)。用水/40％乙腈水溶液梯度洗脱，柱子流速为5ml/min，洗脱级分体积为10ml。在第16至19级分中发现了钠盐，纯溶液的pH为8.5。冷冻干燥后从这些级分得到32mg mumbaistatin钠盐，用HPLC测量的纯度为99％。
溶于甲醇的UV最大值219nm，ε＝33000；257nm，ε＝19500；285nm，ε＝19000；414nm，ε＝5100.
抑制大鼠肝微粒体葡萄糖-6-磷酸移位酶的IC50＝5nM。10μM溶液中微粒体葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用活性证明不到。
实施例4mumbaistatin甲基化产物将18mg根据实施例3所得mumbaistatin溶于50ml水，冷却至0℃，用冷三氟乙酸(TFA)保持pH 2.8。之后直接使所得混合物通过填充有6.2mlMCI GEL CHP20P(75-150um)的柱子(1cm×8cm)，用0.01％TFA至含30％乙腈的0.01％TFA梯度洗脱。流速为2.5ml/min。将洗脱液冷却，含有mumbaistatin的级分直接冷冻至-40℃，冷冻干燥。
将冷冻干燥产物(15mg)溶于甲醇，用重氮甲烷甲基化。在真空中浓缩反应混合物后，通过LiChrosorb RP18，10u柱分离十种以上甲基化产物的混合物，柱子尺寸为1cm×25cm(宽×长)。使用浓度为5至55％的乙腈水溶液作为溶液。在冷却下合并各级分，进一步的加工都保持在冷却条件下。在真空中浓缩级分。第19级分是相当于式XVIIIA的mumbaistatin-单-甲基醚-二甲基酯，分子量为590。关于该化合物的特征NMR数据如上表3所示。3μM溶液对葡萄糖-6-磷酸移位酶的抑制作用42％。
在冷却条件下真空浓缩后，从第34级分得到根据式XIXB的化合物。上表1提供了关于该化合物的结晶学数据。关于上示化合物存在非对映体S，R，R和S，S，S。对葡萄糖-6-磷酸移位酶的抑制作用IC50＝＞100μM。
第26级分所含有的化合物在贮存后是相当于式XIXC的mumbaistatin四甲基衍生物。上表2提供了关于该化合物的有关1H和13C-NMR数据。
实施例5mumbaistatin半缩酮-酰胺(式XXIIIA)在0℃氩气氛下，在搅拌下向10ml mumbaistatin的1ml甲醇溶液中滴加1ml浓氨水溶液。将混合物在该温度下搅拌2小时，随后在真空中除去溶液。得到10mg米色粉末形式的mumbaistatin-酰胺。通过电子喷射质谱法测定分子量(548，M+H+)，相当于化学式C28H21NO11。1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ＝7.8(d，1H)，7.75(t，1H)，7.35(m，1H)，7.25(s，1H)，6.85(t，1H)，6.55(d，1H)，3.85(m，1H)，2.2-2.35(m)，2.05(m，1H)，1.8(m，1H)，1.2-1.4(m)ppm.
式XXIIIA的mumbaistatin-酰胺抑制葡萄糖-6-磷酸移位酶的IC50＝～1μM。
实施例6mumbaistatin内酯二缩酮单-甲基-酯的制备将10mg实施例3所得mumbaistatin溶于1ml无水甲醇，与0.1％TFA水溶液反应，在室温下放置5小时。如实施例3所述通过制备型色谱法纯化反应产物，冷冻干燥后得到含有7mg mumbaistatin内酯单-甲基-酯(式XIXA)的活性级分。该化合物的分子量为544Da(ESI-MS)。
权利要求
1.式I化合物 其中R4、R5、R6和R7独立地是H、OH、卤素、可选被取代的烷基、芳基或酰基、X-烷基或X-芳基，其中的X是O、NH、N-烷基或S，K是下式II或III基团 L是下式IV或V的基团 或者K和L与它们所键合的相应碳原子一起构成下式VI、VII或VIII的基团 其中R1和R3独立地是阳离子、H、烷基或芳基，R2是H、烷基、芳基或酰基，X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7独立地是O、NH、N-烷基或S，cyclus环与标记为“c”和“d”的C原子一起是可选被取代的、饱和、部分不饱和或芳族、碳环或杂环、单一或稠合环系，排除这样的化合物，其中的K是式II基团，L是式IV基团，其中的X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7是O，R1、R2和R3是H，R4是OH，R5、R6和R7是H，cyclus是3，8-二羟基蒽醌，和这样的化合物，其中的K和L一起构成式VI基团，其中的X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7是O，R1是CH3，R2和R3是H，R4是OH，R5、R6和R7是H，cyclus是3，8-二羟基蒽醌，及其药学上可接受的盐、酯和醚和其他明显的化学等价物，所有它们的立体异构与互变异构形式及其任意比例的混合物。
2.如权利要求1所定义的式IX化合物 其中M是式X基团 N是式XI基团-X5R3XI或者M和N与它们所键合的C原子一起构成式XII残基 它是通过标记为“e”的C原子键合的，O是式XIII基团 P是式XIV基团-X5R2XIV或者O和P与它们所键合的C原子一起构成式XV残基 它是通过标记为“f”的C原子键合的，其中的R1至R7、X1至X7、cyclus、c和d是如权利要求1所定义的，及其药学上可接受的盐、酯和醚和其他明显的化学等价物，所有它们的立体异构与互变异构形式及其任意比例的混合物。
3.如权利要求1所定义的下式XVIII化合物 其中R1至R7、X1至X7、cyclus、c和d是如权利要求1所定义的，及其药学上可接受的盐、酯和醚和其他明显的化学等价物，所有它们的立体异构与互变异构形式及其任意比例的混合物。
4.如权利要求1所定义的式I化合物或如权利要求3所定义的式XVIII化合物，其中R1、R2和R3是烷基。
5.如权利要求4所定义的式XVIII化合物的制备方法，包含使其中R1、R2和/或R3是H的式XVIII化合物与烷基化剂反应，再分离反应产物。
6.如权利要求1或权利要求2所定义的下式XIX化合物 其中R1、R4至R7、X1至X7、cyclus、c和d是如权利要求1所定义的，及其药学上可接受的盐、酯和醚和其他明显的化学等价物，所有它们的立体异构与互变异构形式及其任意比例的混合物。
7.如权利要求6所定义的式XIX化合物，其中R1是烷基，R4是OH或烷氧基。
8.如权利要求6所定义的化合物的制备方法，包含使其中R1是H且R4是OH的式XIX化合物的溶液与烷基化剂反应，再分离反应产物。
9.如权利要求7所定义的化合物的制备方法，包含使其中R1是H且R4是OH的式XIX化合物的溶液在烷基醇中与酸反应，再分离反应产物。
10.如权利要求1或权利要求2所定义的下式XX化合物 其中R1至R7、X1至X7、cyclus、c和d是如上权利要求1所定义的，及其药学上可接受的盐、酯和醚和其他明显的化学等价物，所有它们的立体异构与互变异构形式及其任意比例的混合物。
11.如权利要求1所定义的下式XXI化合物 其中R1至R7、X1至X7、cyclus、c和d是如权利要求1所定义的，及其药学上可接受的盐、酯和醚和其他明显的化学等价物，所有它们的立体异构与互变异构形式及其任意比例的混合物。
12.如权利要求1所定义的下式XXII化合物 其中R1至R7、X1至X7、cyclus、c和d是如权利要求1所定义的，及其药学上可接受的盐、酯和醚和其他明显的化学等价物，所有它们的立体异构与互变异构形式及其任意比例的混合物。
13.如权利要求12所定义的式XXII化合物，其中R1至R7是H，X3是NH，R4是OH。
14.如权利要求1或权利要求2所定义的式XXIV化合物 其中R1至R7、X1至X7和cyclus是如权利要求1所定义的，及其药学上可接受的盐、酯和醚和其他明显的化学等价物，所有它们的立体异构与互变异构形式及其任意比例的混合物。
15.分别如权利要求3、12或14所要求保护的式XVIII、XXII或XXIV化合物的制备方法，其中-X3R3是-NH2，该方法包含使其中X3R3是OH的式XVIII、XXII或XXIV化合物与酰胺源反应。
16.根据权利要求15的方法，其中的式XVIII化合物是mumbaistatin。
17.分别如权利要求1-4、6、7和10-14任意一项所定义的化合物，其中X1至X7中任意一个或多个是O。
18.分别如权利要求3、4、6、7、10-14、17任意一项所定义的化合物，其中标记为星号的碳具有S构型，并且权利要求1中的除外情况不适用。
19.如前述权利要求任意一项所定义的化合物，其中的cyclus是选自可选被取代的苯基、苄基、萘基、菲或蒽醌的基团。
20.如权利要求19所定义的化合物，其中的cyclus可选地被OH、C1-C4-烷基、-OC1-C3-烷基、氨基、硝基、卤素、-NH-C1-C4-烷基、羧基和氰基中的一个或多个取代。
21.如权利要求19或20所定义的化合物，其中的cyclus是3，8-二羟基蒽醌。
22.如前述权利要求任意一项所定义的化合物或其药学上可接受的盐作为药物使用。
23.药物组合物，其包含有效量的如权利要求1至4、6、7、10至14、17至22任意一项所定义的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
24.使用如权利要求1至4、6、7、10至14、17至22任意一项所定义的化合物或其药学上可接受的盐作为葡萄糖-6-磷酸移位酶的抑制剂。
25.如权利要求1至4、6、7、10至14、17至22任意一项所定义的化合物或其药学上可接受的盐用于糖尿病治疗中。
全文摘要
本发明涉及新颖的芳族二酮基衍生物和它们的药学上可接受的盐、酯、醚和其他明显的化学等价物。这些衍生物是葡萄糖－6－磷酸移位酶抑制剂,能够用于糖尿病的治疗。本发明进一步涉及这些衍生物的制备方法,涉及这些衍生物和它们的药学上可接受的盐、酯、醚和其他明显的化学等价物作为药物的用途,特别是它们在糖尿病治疗中的用途,还涉及包含这些衍生物、其药学上可接受的盐、酯、醚或其他明显的化学等价物的药物组合物。
文档编号C07C65/40GK1379752SQ00814463
公开日2002年11月13日 申请日期2000年8月19日 优先权日1999年10月25日
发明者L·沃泰希, M·库尔兹, E·保洛斯 申请人:阿文蒂斯药物德国有限公司