专利名称：蛇葡萄素在制备血管生成抑制剂的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛇葡萄素在制药领域的应用，特别是蛇葡萄素在制备血管生成抑制剂的药物中的应用。
背景技术：
蛇葡萄素是中国华南一带分布广泛的葡萄科几种蛇葡萄属植物(如无莉根、藤茶等)的主成份。蛇葡萄素又名二氢杨梅素，属黄酮类化合物，其结构式为 化学名3，5，7，3’，4’，5’-六羟基-2，3-二氢黄酮。
无莉根为粤蛇葡萄[Ampelopsis cantoniensis(HooK.etArm)Planch]的根或全株，主产于我国华南一带，是民间传统用药。《中药大辞典》记载，其具消炎解毒之功用，主治骨髓炎、急性淋巴炎、急性腮腺炎、脓包症、湿症丹毒、疥肿等。藤茶为显齿蛇葡萄[Ampelopsisgrossedentata(Hand.-Mazz.)W.T.Wang]的制品。自20世纪70年代开始蛇葡萄素逐渐引起人们的关注，对其提取纯化、分离鉴定、结构分析等已进行了较完整的研究。中国专利00117225.5报道了其具有抗肿瘤的作用，中国专利申请01109641.1报道了蛇葡萄总黄酮组合物，其中蛇葡萄素占10～70％，具有保肝作用。迄今为止，未见有蛇葡萄素在制备血管生成抑制剂药物中应用的报道。
发明内容
本发明的内容就在于进一步提供蛇葡萄素的新用途即其在制备血管生成抑制剂的药物中的应用。
蛇葡萄素可采用无莉根、藤茶按常规方法提取，也可以采取人工合成的方式制备。
本发明的蛇葡萄素可以采用药剂学上允许的任何剂型均有效。包括口服剂型如片剂、胶囊、口服液等，也可以采用注射剂，如注射液、输液、粉针等，还可以采用外用剂型，如软膏、霜剂、搽剂等。当采用口服剂型及外用剂型时，蛇葡萄素可采用无莉根或藤茶的水提物或醇提物的未经纯化的混合提取物的方式。也可采用其它含有蛇葡萄素的植物的提取物，而不必采用纯度非常高的蛇葡萄素。
本发明优选地采用蛇葡萄素的注射剂的方式，成年人使用剂量为500～1000毫克/天，一日一次，可以皮下或肌肉注射，或静脉注射或滴注。
血管生成是实体肿瘤(生长血管生成是实体瘤)生长和转移过程中的特性表现。肿瘤的生长有赖于新生血管形成，一些恶性肿瘤的生长和转移过程中不断有新生血管出现。当肿瘤直径达到或超过1-2mm时，经微循环渗透提供的营养物质已经不能满足肿瘤的生长需要，此时向肿瘤提供营养物质的血管逐步形成。这样由宿主组织血循环形成的毛细血管网最终进入肿瘤组织；且研究发现肿瘤体积超过2mm3时，如果没有新生血管长入，肿瘤组织将保持静止状态或发生退化，反之，肿瘤体积呈指数倍增长。无疑内皮细胞的生长在血管生成的过程中起着最直接的作用，而抑制血管内皮细胞增殖、促进其凋亡/死亡即是所有抑血管生成药物的最终治疗目的。抑血管内皮细胞增殖药物或血管生成抑制剂除可应用于抑制肿瘤生长外，还可应用于如创伤修复中的疤痕组织形成、糖尿病视网膜病变、类风湿关节炎滑膜血管翳形成，目前针对血管内皮生长因子VEGF及其受体与眼内新生血管性疾病的作用机制采取的抗眼内新生血管形成的研究已成为眼科领域的热点。另外VEGF可作为类风湿关节炎病情活动的指标，抗VEGF有望成为类风湿关节炎治疗的一种新的发展方向。本发明通过MTT法(四氮唑蓝)检测蛇葡萄素对血管内皮细胞的增殖具有明显的抑制作用。不仅揭示蛇葡萄素抗肿瘤作用的机制，也说明其可用于抗血管生成。
本发明选择对肿瘤血管生成起关键作用比较大的血管内皮生长因子VEGF及碱性成纤维细胞生长因子bFGF作为观测指标，选择分泌两种因子均比较高的Bel-7402人肝癌细胞作为实验对象，进一步考察蛇葡萄素血管生成抑制的作用机制。先用免疫组化法检测，发现所有肝癌细胞均合成分泌这两种因子，而蛇葡萄素组的合成量明显减少，流式细胞仪结果显示蛇葡萄素38.4μg/mL、25.6μg/mL浓度组VEGF灰度与溶剂组之间存在显著性差异(P＜0.05)，38.4μg/mL、25.6μg/mL、12.8μg/mL浓度组bFGF灰度与溶剂组之间存在显著性差异(P＜0.05)。VEGF可以通过活化的磷脂酶C(PLC)和刺激第二信使的形成直接促进血管内皮细胞的有丝分裂，促进形成血管内皮细胞生长的必须基质-纤维蛋白凝胶。bFGF对血管生成也起重要作用，是血管内皮细胞很强的促分裂剂和趋化因子，与VEGF有协同作用，甚至可以诱导VEGF的表达。本发明的实验表明，蛇葡萄素对VEGF及bFGF的合成和分泌有抑制作用，进而抑制血管生成。迄今为止，尚无公认的抑血管生成药物上市，本发明采用阿霉素作对照，但实验表明对照阿霉素组对VEGF和bFGF无抑制分泌作用。
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例的范围之内。
具体实施例方式
实施例1取葡萄科蛇葡萄属植物粤蛇葡萄或显齿蛇葡萄的根无莉根，采用常规的提取方法提取、纯化制备蛇葡萄素，分装成500mg/支的粉针安瓿或注射液。
实施例2取藤茶经常规提取蛇葡萄素提取物，不经纯化，经含量测定后，按常规方法添加辅料，制粒，过筛，添加助流剂硫酸镁、滑石粉；按片剂常规生产工艺加工成片剂，每片含蛇葡萄素250mg。
实施例3 MTT法牛主动脉内皮细胞增殖抑制实验3.1.1新生牛主动脉内皮细胞的分离培养参考文献[柴伟栋，等.胎牛主动脉内皮细胞的培养.南京医科大学学报，2000，20(3)173]方法，取新生健康乳牛，颈动脉放血处死，无菌条件下分离主动脉，长12-15cm，装入加双抗的PBS中(青霉素、链霉素各100U/mL)。在超净台上取出动脉，清除动脉外壁的筋膜和脂肪，用pH7.4的无菌PBS磷酸盐缓冲液(浓度mmol/LNaCl130，KCl 2.5，Na2HPO410，KH2PO41.5)反复冲洗3-5次，在培养皿上沿正中剪开。在动脉内壁滴上一层0.25％胰酶，10-20秒(s)后立即用含10％小牛血清的M199培养基终止消化。用细胞刮轻轻刮下动脉内层细胞，于培养皿中加入适量M199完全培养基，37℃、饱和湿度、5％CO2细胞培养箱培养20-30min(分钟)后，将未贴壁的细胞转入细胞培养瓶，加适量培养基培养。24h后吸去上清，加入新鲜培养基继续培养，在相差显微镜下见成片的鹅卵石样内皮细胞，并有接触抑制现象。免疫组化实验，内皮细胞第VIII因子相关抗原反应阳性。以后用含10％小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的M199培养基，在37℃、饱和湿度、5％CO2细胞培养箱培养，每3天换液一次，长满后用0.25％胰蛋白酶消化传代。
3.1.2蛇葡萄素对新生牛主动脉内皮细胞的增殖抑制作用参考文献[宋维华，等.MTT法测定矿物质提取物MICOM及中药提取物AN4的体外抗肿瘤活性.哈尔滨医科大学学报，2001，35(6)402]方法，将传代培养的内皮细胞以0.25％胰酶消化、吹打成单细胞悬液，1％台盼蓝染色，细胞活力＞95％，显微镜下计数，用培养基稀释后以5×104/孔(200μL)接种于96孔板，培养12h(小时)后分组，每组6复孔，分别加入含不同浓度蛇葡萄素的培养基，并设阴性对照组和溶剂对照组，继续培养48h。在实验结束前4h吸去培养基，用PBS洗，加入PBS配制的0.5μg/mL MTT(四氮唑蓝)200μL/孔，继续培养至实验结束。小心吸去上清，加入DMSO(二甲基亚砜)150μL/孔，震荡10min充分溶解细胞沉淀，在1h内用酶标仪于490/570nm处测吸光度(A)值，减去零孔A值后，计算增殖抑制率如下 用插值法计算IC50。实验重复共3次。
3.1.3统计学处理应用SAS v6.12统计软件对实验结果进行单因素方差分析。
3.2结果3.2.1蛇葡萄素对新生牛主动脉内皮细胞的增殖抑制作用如表1所示为数组内皮细胞经不同处理后的增殖情况，吸光度与增殖程度成正比。可以看出蛇葡萄素19.2μg/mL以上各浓度组内皮细胞增殖抑制明显，在浓度为6.4-51.2μg/mL范围内，浓度与抑制率呈线性相关(r＝0.9718，p＜0.01)，IC50＝22.0±4.0μg/mL。
3.2.2结果分析应用SAS v6.12统计软件包对所有结果进行单因素方差分析，采用Dunnett-t检验法对蛇葡萄素各浓度组与溶剂对照组进行检验。结果发现蛇葡萄素51.2μg/mL、38.4μg/mL、25.6μg/mL浓度组与溶剂组之间存在显著性差异(P＜0.05)；而12.8μg/mL及以下浓度组与溶剂对照组无明显差异(P＞0.05)。结果表明，蛇葡萄素具有抑制血管内皮细胞增殖的作用，可用于抗血管生成。
表1 MTT法牛主动脉内皮细朡增殖抑制实验(n＝6) 实施例4 蛇葡萄素对肝癌细胞分泌VEGF、bFGF抑制实验4.1 ELISA法和免疫组化染色法测定人Bel-7402肝癌细胞分泌的VEGF、bFGF4.1.1细胞培养人肝癌Bel-7402细胞，用含10％小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基，在37℃、饱和湿度、5％CO2细胞培养箱培养，用0.25％胰蛋白酶消化传代。
4.1.2 ELISA法测定Bel-7402细胞分泌的VEGF将传代培养的7402细胞以0.25％胰酶消化、吹打成单细胞悬液，1％台盼蓝染色，细胞活力＞95％，显微镜下计数，用培养基稀释后以5×104/孔(1mL)接种于24孔板，培养12h后分组，每组4复孔，分别加入含不同浓度蛇葡萄素的培养基(12.8μg/mL、25.6μg/mL、51.2μg/mL)，并设阴性对照组和溶剂对照组，继续培养72h。
提前20min从冰箱取出VEGF-ELISA试剂盒，以平衡至室温。24孔板中每孔吸出100μL上清，每组为一个样本，共6样本，离心2000-3000转/min共20min，细胞则以4％多聚甲醛固定20-30min，放回4℃中。
将浓缩洗涤液7mL用双蒸水稀释到140mL。取60μL用培养基将VEGF标准品稀释到600μL，后倍比稀释到共6个浓度。从已平衡至室温的密封袋中取出24T，余板条密封放回4℃中。除空白板外，分别将不同浓度样品/标准品以100μL/孔加入相应孔中，每样2复孔，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育90min。分别将生物素化抗体工作液和酶结合物工作液25μL以专用稀释液稀释到250μL，提前15min配置，其中酶结合物工作液需避光放置。用洗涤液洗板4～5次，350μL/孔，静止30s；除空白板外，加入生物素化抗体工作液100μL/孔，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育60min。同前洗板4～5次；除空白板外，加入酶结合物工作液100μL/孔，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育30min。洗板4～5次；加入底物显色剂100μL/孔，37℃避光孵育10-15min。加入终止液100μL/孔，低频振荡器混匀后立即用酶标仪测量A值(450nm，5min内)。每个标准品和标本的A值减去零孔A值，以标准品浓度的对数作横坐标，A值作纵坐标，得到标准曲线。通过标本的A值可在标准曲线上查出其浓度。然后按下式计算抑制率
4.1.3免疫组化染色法测定Bel-7402细胞分泌的VEGF、bFGF取出已固定细胞的24孔板，每孔加入新鲜配制的3％H2O2200μL/孔，室温放置10-20min灭活剩余的过氧化物酶，用蒸馏水洗3次，每次5min。吸干，加入正常山羊血清封闭液，室温放置20min，吸去多余液体后加稀释的一抗(兔抗人VEGF多克隆抗体)4℃孵育过夜；其中VEGF或bFGF浓缩型一抗以含0.1％Triton PBS(pH7.2-7.6)按1∶300稀释后使用。次日于37℃孵育60min，0.1％Triton PBS洗3次，每次5min。加生物素化羊抗兔lgG二抗，37℃孵育20min，PBS同前洗去。然后滴加试剂SABC(链霉素-亲合素-生物素复合物)，室温孵育10-20min，PBS洗3次，每次5min。1mL蒸馏水加显色剂A、B、C各1滴，混匀，加至标本上，显色至出现背景色。用PBS充分洗涤以终止反应，于相差显微镜下拍照。
4.2流式细胞仪测定Bel-740细胞分泌的VEGF、bFGF4.2.1细胞培养人肝癌Bel-7402细胞，用含10％小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的RPMI-1640培养基，在37℃、饱和湿度、5％CO2细胞培养箱培养，用0.25％胰蛋白酶消化传代。
4.2.2流式细胞仪测定Bel-7402细胞分泌的VEGF、bFGF收集对数生长期的人肝癌Bel-7402细胞，胰酶消化后吹打成单细胞悬液，1％台盼蓝染色，细胞活力＞95％，显微镜下计数，用培养基稀释后以3×105/瓶接种于18个50mL玻璃培养瓶，培养12h后吸去上清，加入含不同浓度蛇葡萄素的培养基，同时设阴性对照组、溶剂对照组和阳性对照组(阿霉素5μg/mL)，每浓度组3瓶细胞，继续培养72h。收集培养的细胞，每浓度组为一个样本，每样本分2管，每管各加入100μL(含106个细胞)，然后加入固定剂100μL室温固定1h，再加入破膜剂500μL，离心去上清，再加入300μL破膜剂，室温10min后离心去上清，其中实验管用破膜剂1∶100稀释一抗(兔抗人VEGF单克隆抗体)，每管加50μL，室温孵育30min，然后加500μL PBS(无Triton)洗2次，最后所有管都加入1∶60二抗(FITC标记的羊抗兔lgG)100μL，室温孵育30min，加500μL PBS洗2次上机。上机前激光管预热30min，用荧光微球调整仪器，使各放大器接收的信号的HCV值＜2％，以对照管作为空白定标，计算10000个细胞，记录标本的平均荧光强度，按下式计算抑制率 计算阳性对照组抑制率则改为 4.3结果4.3.1 ELISA法和免疫组化染色法测定人Bel-7402肝癌细胞分泌的VEGF、bFGF表2、3所示，标准曲线结果标准品浓度的对数与其A值呈线性相关(y＝1.1366x-0.462，r＝0.9997，P＜0.01)。蛇葡萄素各浓度组比照溶剂组有显著性差异(P＜0.05)。免疫组化染色见各组细胞均有分泌VEGF、bFGF，药物组细胞体积缩小，染色面积明显减少。
应用SAS v6.12统计软件包对所有结果作单因素方差分析，采用Dunnett-t检验法对蛇葡萄素各浓度组分别与溶剂对照组进行检验。结果发现蛇葡萄素38.4μg/mL、25.6μg/mL、12.8μg/mL浓度组与溶剂组之间存在显著性差异(P＜0.05)。
4.3.2流式细胞仪测定Bel-7402细胞分泌的VEGF、bFGF表4、5所示为2次流式细胞仪VEGF、bFGF灰度检测结果，见蛇葡萄素各浓度组较溶剂组浓度降低，且随药物浓度升高，VEGF、bFGF浓度有降低趋势；而阳性对照组(阿霉素)较阴性对照组无明显变化，甚至略有升高。另外蛇葡萄素51.2μg/mL组VEGF、bFGF灰度较38.4μg/mL组为高，结合阳性对照组结果，考虑为细胞增殖抑制刺激了生长因子的分泌。
应用SAS v6.12统计软件包对第一次实验结果作单因素方差分析，采用Dunnett-t检验法对蛇葡萄素各浓度组分别与溶剂对照组进行检验。结果发现蛇葡萄素38.4μg/mL、25.6μg/mL浓度组VEGF灰度与溶剂组之间存在显著性差异(P＜0.05)；而蛇葡萄素38.4μg/mL、25.6μg/mL、12.8μg/mL浓度组bFGF灰度与溶剂组之间存在显著性差异(P＜0.05)。
以上实验结果表明蛇葡萄素38.4μg/mL、25.6μg/mL浓度组能有效地抑制Bel-7402人肝癌细胞合成VEGF和bFGF，而阳性对照组无此作用。本实施例进一步说明了蛇葡萄素抑制血管生成机制。
表2 标难品及各药物组A值
表3 ELISA法测定各药物组VEGF分泌抑制率
表4 流式细胞仪法测定VEGF、bFGF结果一
表5 流式细胞仪法测定VEGF、bFGF结果二
权利要求
1.蛇葡萄素在制备血管生成抑制剂的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的蛇葡萄素在制备血管生成抑制剂的药物中的应用，其特征在于采用药剂学上允许的注射剂型。
3.根据权利要求1所述的蛇葡萄素在制备血管生成抑制剂的药物中的应用，其特征在于采用药剂学上允许的口服剂型。
4.根据权利要求1或3所述的蛇葡萄素在制备血管生成抑制剂的药物中的应用，其特征在于口服剂型中蛇葡萄素采用无莿根的未经纯化的提取物。
5.根据权利要求1或3所述的蛇葡萄素在制备血管生成抑制剂的药物中的应用，其特征在于口服剂型中蛇葡萄素采用藤茶的未经纯化的提取物。
6.根据权利要求1所述的蛇葡萄素在制备血管生成抑制剂的药物中的应用，其特征在于采用药剂学上允许的外用剂型。
全文摘要
蛇葡萄素在制备血管生成抑制剂的药物中的应用，本发明考察了蛇葡萄素对血管内皮细胞的增殖的抑制功能，还考察了蛇葡萄素对人肝癌细胞合成分泌VEGF、bFGF的抑制作用，结果表明蛇葡萄素对血管内皮细胞的增殖有抑制作用，对VEGF、bFGF的合成分泌有抑制作用，表明蛇葡萄素可望作为血管生成抑制剂，实验表明无论采用口服、注射剂型均有效。
文档编号A61P35/00GK1634028SQ20041005215
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月11日 优先权日2004年11月11日
发明者刘德育 申请人:中山大学