脂联素在制备治疗骨折的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及脂联素在制药中的新用途，更具体地，涉及脂联素在制备治疗骨折的 药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 四肢伤在战伤中所占的比例非常高，其中骨折在战伤所致四肢伤中约占60%。在平 时的工农业生产、交通运输、体育运动和军事训练中，骨折也是常见的意外事故。在各城市 创伤中心，约45. 5%的住院患者存在骨折，其中，股骨干骨折是最常见的四肢骨折损伤。
[0003] 骨折愈合时间视部位不同而有所差异，通常下肢骨折的修复时间相对较长。股骨 干骨折一般需要8~12周，而股骨颈骨折恢复时间最长，需要12~24周。枪击伤至股骨 骨折的愈合时间与创伤骨折所需时间类似。如果能够缩短骨折修复时间，增加修复骨痂的 强度，对于尽快恢复和改善生活质量有着重要作用。
[0004] 随着生物技术的发展，临床及基础研究中应用细胞因子治疗骨病已取得了可喜的 效果。脂联素是一种脂源性细胞因子，主要由脂肪组织分泌，体内含量丰富，血清中的浓度 高达5~30i! g/L，约占总血清蛋白的0. 01%以上。人类脂联素基因位于3g27,长约17kb， 包含3个外显子和2个内含子。脂联素由244个氨基酸组成，一级序列分析显示其包含4 个功能区：前18个氨基酸的信号肽、23个氨基酸组成的氨基端非螺旋功能区、一段22个胶 原重复序列和137个氨基酸组成的羧基端球形结构域。全长型的脂联素和脂联素的水解 产物-球形结构（gACRP30)都具有生物活性。2004年Berner等最先在人类的股骨和胫骨 成骨细胞中发现了脂联素及其受体AdipoRl/2的表达，在体外重组脂联素可促进小鼠成骨 细胞的增殖，初步证实了脂联素参与骨的代谢(参见Berner HS等，Adiponectin and its receptors are expressed in bone-forming cells, Bone, 20040ct;35(4):842-9)。进一 步研究表明，重组脂联素分别通过AdipoR/JNK和Adip〇R/p38促进成骨细胞的增殖和分化， 且具有时间和剂量的依赖性。
[0005] 但是，虽然现有技术已经确定了脂联素能够影响骨代谢，但关于脂联素对创伤骨 折修复、骨痂强度等的影响，其最佳给药剂量、给药方式等尚没有相关研究，这对本领域技 术人员来说是未知的。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供脂联素的医药新用途。
[0007] 具体地说，本发明涉及脂联素在制备治疗骨折的药物中的应用。
[0008] 所述骨折包括线性骨折、粉碎性骨折和骨缺损。特别地，所述骨折为四肢骨折，进 一步地，所述骨折为股骨骨折。
[0009] 所述药物是指含有脂联素的骨渣、含有脂联素的附着制剂、粉剂或注射剂等，所述 含有脂联素的附着制剂优选为含有脂联素的医用明胶海绵。
[0010] 本发明中所述药物的给药方式包括在骨间植入含有脂联素的骨渣、用含有脂联素 的附着制剂(医用明胶海绵等）填塞、粉剂直接涂敷和注射给药中的至少一种。
[0011] 所述注射给药包括在骨折断端局部注射给药、腹腔注射给药、皮下注射给药、肌肉 注射给药及静脉注射给药中的至少一种。
[0012] 特别地，在局部注射给药时，以每次0. 05~lmg/kg体重脂联素的剂量给药，每月 给药1~4次到每日给药1~3次的频次均可。在皮下注射、腹腔注射、肌肉注射或静脉注 射等注射给药时，以每次0. 2~20mg/kg体重脂联素的剂量给药，每月给药1~4次到每日 给药1~3次的频次均可。优选为以每次1~4mg/kg体重脂联素的剂量给药，每日给药1 次。
[0013] 此外，本发明还提供一种用于治疗骨折的药物组合物，其含有IOOyg~1000 mg脂 联素和药学上可接受的辅料，优选的含有2. 5mg~50mg脂联素和药学上可接受的辅料。 [0014]本发明首次将脂联素应用于促进骨愈合以及治疗骨折中。经试验证实，脂联素能 够显著加快骨痂形成、增强骨痂强度、提高骨折愈合速度、缩短骨愈合的时间，对粉碎性骨 折、线性骨折和骨缺损等均有良好的治疗效果，特别是对愈合缓慢的股骨骨折有明显的促 进愈合作用，为骨折的临床治疗提供了新的方法。
【附图说明】
[0015] 图1是表示流式细胞仪测定脂联素对成骨细胞增殖影响的图，其中，*表示有显著 差异。
[0016] 图2是表示[3H]游离胸苷摄入法测定脂联素对大鼠原代成骨细胞、人成骨细胞和 大鼠破骨细胞影响的图，其中，A为对大鼠原代成骨细胞以不同浓度脂联素干预24h的结果 的图；B为对大鼠原代成骨细胞以不同浓度脂联素干预8h、24h和48h的结果的图；C为对人 成骨细胞以不同浓度脂联素干预24h和48h的结果的图；D为对大鼠破骨细胞以不同浓度 脂联素干预24h的结果的图。
[0017]图3是表示脂联素尾静脉注射对小鼠骨结构影响的图，其中，#表示有显著差异。[0018] 图4是表示骨断端局部注射脂联素治疗骨折的照片。
[0019]图5表示脂联素局部注射给药的骨生物力学-最大载荷的图。
[0020] 图6表示脂联素腹腔注射给药的骨生物力学-最大载荷的图。
[0021] 图7表示脂联素皮下注射给药的骨生物力学-最大载荷的图。
[0022] 图8表示脂联素静脉注射给药的骨生物力学-最大载荷的图。
[0023] 图9表示含脂联素的骨渣填塞的骨生物力学-最大载荷的图。
[0024] 图10表示含脂联素的明胶海绵填塞的骨生物力学-最大载荷的图。
【具体实施方式】
[0025] 本发明提供了脂联素在制备治疗骨折的药物中的应用。
[0026] 所述骨折包括线性骨折、粉碎性骨折和骨缺损。特别地，所述骨折为四肢骨折，进 一步地，所述骨折为股骨骨折。
[0027] 所述药物是指含有脂联素的骨渣、含有脂联素的附着制剂、粉剂或注射剂等，其 中，含有脂联素的附着制剂优选含有脂联素的医用明胶海绵。
[0028]具体地说，所述含有脂联素的骨渣，是将获得的小鼠同种异体骨表面软组织、骨膜 和骨端软骨彻底剔除，根据需要制成大于Imm的移植骨材料，使用无菌盐水进行加压冲洗 尽量去除骨髓组织；在根据不同给药组配制成的1~5 y g/g浓度的脂联素溶液中进行无菌 浸泡，然后进行无菌包装，采用逐渐降温法，先将移植骨放人-4°C的冷库中，12h后再逐渐 降至-80°C保存。将新制成的深冻骨放入干燥机内，使骨组织内剩余水分降低到5%以下，然 后进行无菌包装，置于无菌真空容器中常温保存。所有移植骨渣均采用射线照射消毒处理 后无菌封装备用。
[0029] 所述含有脂联素的医用明胶海绵，是将医用吸收性明胶海绵等附着制剂剪成 I. 5_2小块，脂联素溶于生理盐水中后与医用明胶海绵充分混合(复合材料)，制成含脂联 素的附着制剂，环氧乙烷熏蒸消毒，于4°C保存备用。
[0030] 所述注射剂，是将购买的脂联素粉末制剂(购自Sino Biological公司，纯度大于 97%)，以无菌水或其他消毒溶剂(例如生理盐水、葡萄糖等)溶解制备成0. 002~0. 4mg/L的 脂联素注射液。
[0031] 本发明中，所述药物的给药方式包括在骨间植入含有脂联素的骨渣、用含有脂联 素的附着制剂填塞、粉剂直接涂敷和注射给药中的至少一种。
[0032] 所述注射给药包括在骨折断端局部注射给药、腹腔注射给药、皮下注射给药、肌肉 注射给药及静脉注射给药中的至少一种，优选为在骨折断端局部注射给药。
[0033] 此外，在局部注射给药时，以每次0. 05~lmg/kg体重脂联素的剂量给药，每月给 药1~4次到每日给药1~3次的频次均可。在皮下注射、腹腔注射、肌肉注射或静脉注射 等注射给药时，以每次0. 2~200mg/kg体重脂联素的剂量给药，每月给药1~4次到每日 给药1~3次的频次均可。优选为以每次1~4mg/kg体重脂联素的剂量给药，每日给药1 次。
[0034] 下面结合实施例进一步说明本发明，本发明中所使用的脂联素购自北京盛世中方 公司，另外，除非特别说明，本发明所用到的试剂、培养基均为市售商品。
[0035] 实施例1细胞干预实验
[0036] 大鼠成骨细胞的提取：外科手术取大鼠的髂骨松质骨并剪成2mmX 1_X Imm大小 的碎片，用磷酸盐缓冲液（PBS)冲洗摇荡3次，加入lg/L IV型胶原酶于37°C下振摇消化， 待松质骨变白并呈蜂窝状时,加入含体积分数为0. 2胎牛血清的无酚红MEM终止消化，用含 体积分数为〇. 1胎牛血清的MEM洗涤3次，待洗液中不含细胞时，将骨片贴于25cm2培养瓶 壁,加入含体积分数为0. 15胎牛血清的MEM，其中含50mg/L抗坏血酸、青霉索50U/mL、庆大 霉素50mg/L，在37°C、体积分数为0. 05的CO2条件下培养。两天后换液，以后每3天换液 1次，培养约15天后，可见有细胞游出，约25天后达汇片，用2. 5g/L胰酶-EDTA (Sigma公 司）消化液消化，再接种到25cm2培养瓶中，细胞数为5 X IO5个/瓶。
[0037] 大鼠破骨细胞的提取：收集大鼠骨髓，细胞培养6天后，进行体外骨髓破骨细胞样 细胞的培养，以抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP)染色鉴定(抗酒石酸酸性磷酸酶