茜草科类型环肽用作为Hedgehog信号通路抑制剂和其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供茜草科类型环肽用作为Hedgehog信号通路的新型抑制剂，其制备方法及在制备治疗与预防Hedgehog信号通路异常激活的有关癌症的药物中的应用。本发明的茜草科类型环肽，由1个D-α-丙氨酸，1个L-α-丙氨酸，3个取代的N-甲基-L-α-酪氨酸和一个其它类型的L-α-氨基酸经肽键缩合而成，且6个氨基酸缩合成为十八元环，其中2个邻位的酪氨酸之间的苯环经氧桥连接形成一个十四元环。
【专利说明】茜草科类型环肽用作为Hedgehog信号通路抑制剂和其制备方法与应用
【技术领域】:
[0001]本发明属于药物【技术领域】，具体地，涉及一系列茜草科类型环肽用作为Hedgehog信号通路抑制剂，以其作为有效成分的药物组合物，其制备方法及其在癌症治疗及预防中的应用。
【背景技术】:
[0002]Hedgehog信号通路是细胞内经典而重要的信号转导通路之一，该通路的激活可调节多种下游基因的转录表达，并由此影响细胞的增殖，分化，凋亡和迁移。因此，该信号通路在动物早期胚胎发育和成体组织器官的稳态平衡过程中起着重要的作用，其功能的异常紊乱与众多人类疾病密切相关，如婴儿出生缺陷和癌症的产生。
[0003]Hedgehog信号通路最早在果蝇的遗传突变筛选中被发现参与胚胎体节极性的形成。随后很快在脊椎动物中克隆和鉴定了 Hedgehog蛋白的同源基因Sonichedgehog(Shh), Indian hedgehog(Ihh), Desert hedgehog(Dhh)。其中研究最深入的是Shh0
[0004]在脊椎动物的Hedgehog信号转导途径中，Shh是配体，Patched (Ptch)是受体，Ptch是一个12次跨膜蛋 白，有两个同源基因:Ptchl和Ptch2。在没有Shh信号时，Ptch抑制下游7次跨膜蛋白Smoothened(Smo), Smo是G蛋白偶联受体,从而没有信号转导到下游。当Shh信号存在时,配体Shh和受体Ptch结合一起被胞吞,从而解除对Smo的抑制,Smo激活下游的转录因子Gli入核，Gli激活不同靶基因的转录表达，实现Hedgehog信号通路的激活。Gli是Hedgehog信号通路最下游的转录因子，脊椎动物中有3个同源基因:Glil，Gli2，Gli3，都是致癌基因。Glil是一转录激活因子，Gli2和Gli3是双功能转录因子，全长形式是转录激活因子，当被蛋白酶体部分降解修饰后的截短形式是转录抑制因子。Sufu是一转录共抑制因子，能和三个Gli结合,阻止Gli入核从而抑制Hedgehog信号通路。Hedgehog信号通路的靶基因包括 Glil,Ptchl,Hhipl, Cyclin D, Cyclin E, N-Myc, Bcl2, VEGF, Jag2,Snail, Slug, Twist2，BmiI, Lgr5，CD44，CD133，PTHrP 等，一方面对自身信号通路进行精细的反馈调节，另一方面调控细胞的多种功能行为如:细胞增殖、抗凋亡、血管形成，诱导和维持干细胞特性、细胞命运决定、上皮间充质转化，迁移等。
[0005]Hedgehog信号通路在早期胚胎发育的组织器官形成过程中很活跃，但在成体组织中大部分都被沉默关闭掉，除在组织稳态维持和损伤修复过程中外，由于各种原因导致的Hedgehog信号通路重新激活会导致众多癌症的形成。据目前权威数据统计，三分之一的癌症中都有Hedgehog信号的异常激活。跟Hedgehog信号通路异常激活相关的癌症，根据Hedgehog信号通路在癌症中激活形式的不同分为三种类型:突变导致的I型，如痣样基底细胞癌综合征、基底细胞癌、髓母细胞癌、横纹肌肉瘤等；配体自分泌依赖的II型，如小细胞肺癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、胆管癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤等；配体旁分泌依赖的III型，如前列腺癌、胰腺癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、白血病等。[0006]Hedgehog信号通路还和癌症的骨转移和肿瘤干细胞的维持和分化密切相关。乳腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌和前列腺癌都倾向于骨转移，在乳腺癌中Hedgehog信号能激活上调PTHrP, PTHrP能诱导破骨细胞的形成而促进骨吸收，为癌细胞骨转移提供基础。Hedgehog信号还能激活许多重要的上皮间充质转化调节因子如:Snail，Slug, Twist2, ZebI, Zeb2，Foxc2，上皮间充质转化是癌症转移的重要标志性特征之一。癌症的生长和传播被认为可能依赖于一小群癌干细胞，癌干细胞具有自我更新和多潜能分化的能力，而且这些细胞对化疗和放疗耐受，被认为是癌症复发的主要原因之一。在胶质瘤，乳腺癌，前列腺癌、多发性骨髓瘤和慢性髓细胞样白血病中发现Hedgehog信号通路能直接或间接激活上调一系列重要的干细胞标记分子如Lgr5，⑶44，⑶133，从而参与癌干细胞的诱导和维持。
[0007]综上所述，Hedgehog信号通路以多种多样的形式参与众多癌症的形成，所以知道每种癌症中Hedgehog通路参与的方式对于癌症的治疗和抗癌药物研发非常重要，尤其针对Hedgehog信号通路的抑制剂作为抗癌药的药物研发。Hedgehog信号通路作为抗癌治疗的靶点已受到广泛重视，并且已发现许多该信号通路的抑制剂，其中大部分都针对Smo而发挥作用。其中，Roche公司的⑶C-0449 (又称vismodegib,商品名Erivedge),是一种小分子靶向Smo抑制剂，FDA已于2012年I月份批准其用于治疗局部晚期和已转移的基底细胞癌，是批准用于治疗转移基底细胞癌的第一个药物。但该药在临床研究中治疗髓母细胞瘤病人时，发现Smo出现突变而产生耐药性。所以迫切需要研发其它作用机制的新型Hedgehog信号通路抑制剂用于治疗相关癌症。
[0008]现有技术中未见茜草科类型环肽作为Hedgehog信号通路抑制剂及用于治疗相关癌症的报道。
[0009]茜草科类型环肽在茜草科植物中的分离纯化较为困难，最重要的原因是茜草属植物中富含蒽醌类色素，且环肽含量较低。近年从茜草属植物中分离环肽类成分已公开发表如下方法:(1)茜草科茜草属植物小红参的根用甲醇提取后，甲醇浸膏加水混悬后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，合并乙酸乙酯和正丁醇部分依次用正反相硅胶柱层析，Sephadex LH-20凝胶柱层析，HPLC等技术分离纯化,得到系列环肽。参见:Fan, J.T. et al.Rubiyunnanins C-Hj cytotoxic cyclic hexapeptides from Rubia yunnanensisinhibiting nitric oxide production and NF-κ B activation.Bioorganic&medicinalChemistry, 2010，18，8226-8234。其缺点在于萃取对富集环肽类化合物作用不明显，工作量大且效率低。(2)茜草科茜草属植物茜草的根用甲醇提取后，甲醇浸膏经HP-20大孔树月旨、硅胶、活性炭、氨丙基键合硅胶色谱柱层析得到环肽富集部分。此环肽富集部分用甲醇重结晶，再结合各种层析材料包括HPLC对结晶或母液进行分离纯化，得到一系列环肽。参见:Hitotsuyanagi, Y.et al.1solation, structure determination, and synthesisof al1-RA-V and neo-RA-V, RA-series bicyclic peptides from Rubia cordifoliaL.Chemistry-A European Journal2012, 18, 2839 - 2846。其缺点在于活性炭对样品的吸附性强，氨丙基键合硅胶材料价格较贵，实验室和工业上不常用，甲醇重结晶技术可控性和重现性不好。
【发明内容】
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[0010]针对现有技术存在的上述不足之处，本发明的目的在于提供一类茜草科类型环肽化合物作为新型Hedgehog信号通路抑制剂；提供制备该类化合物的方法；本发明的目的还在于提供以茜草科类型环肽化合物为有效成分的药物组合物；以及在其制备治疗和预防Hedgehog信号通路异常激活的相关癌症的药物中的应用。
[0011]为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案:
[0012]用如下结构式所示的茜草科类型环肽作为Hedgehog信号通路抑制剂，
[0013]
【权利要求】
1.用如下结构式所示的茜草科类型环肽作为Hedgehog信号通路抑制剂，
2.药物组合物，其中含有治疗有效量的如权利要求1所示的茜草科类型环肽化合物RA-V (I)、RA-VII (2)、RA-1 (3), RA-XI (4), RA-XII (5), RA-XXII (6), RA-XXIII (7)、RY-1I (8)和Rubiyunnanin C (9)或其药理学上容许的盐和药学上可接受的载体。
3.权利要求1所述的茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐在制备Hedgehog信号通路抑制剂中的应用。
4.权利要求1所述的茜草科类型环肽或其药理学上容许的盐在制备治疗与预防Hedgehog信号通路异常激活的相关癌症的药物中的应用，所述的癌症为基底细胞癌、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤、痣样基底细胞癌综合征、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、转移性前列腺癌、胰腺癌、软骨肉瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管癌、肝癌、膀胱癌、血管瘤、慢性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤。
5.制备如权利要求1所述的茜草科类型环肽化合物RA-V(I),RA-VII (2),RA-1 (3)、RA-XI (4),RA-XII (5),RA-XXII (6),RA-XXIII (7),RY-1I (8)和 Rubiyunnanin C (9)的方法，取金剑草(Rubia alata Wall, in Roxb.)的根莖,经干燥、粉粹后,用甲醇回流提取3次，时间为2-3小时，提取液经减压浓缩得总浸膏，将总浸膏经硅胶柱层析，用100:0，10:1，8:2,7:3,0:100的氯仿/甲醇梯度洗脱，结合环肽TLC检测方法合并其中的10:1和8:2含有环肽的部分，以下的每一步骤都须结合环肽TLC检测方法来进行分离纯化，合并后的环肽部位再次经硅胶柱层析，用70:1-8:2的氯仿/甲醇梯度洗脱，合并含有环肽部位，得总环肽部位；总环肽部位继续经硅胶柱层析，用30:1-1:1的氯仿/丙酮梯度洗脱，按含环肽的点不同合并为3个组分Fr.1 - Fr.3 ；Fr.1组分经硅胶柱层析，7:3-0:1的石油醚/丙酮梯度洗脱，富集含环肽部位Fr.1-1，Fr.1-1组分经Sephadex LH-20层析，1:1的氯仿/甲醇为洗脱剂，所富集的含有环肽的部分经ODS HPLC制备柱纯化，38%乙腈和4%。三氟乙酸为洗脱剂，得到 RA-V (1)，RA-VII (2), RA-XXII (6), RA-XXIII (7), Rubiyunnanin C (9);Fr.2 组分经硅胶柱层析，30:1-1:1的氯仿/丙酮梯度洗脱，富集含环肽部位经Sephadex LH-20层析，I: I的氯仿/甲醇为洗脱剂，合并含环肽部位Fr.2-1 ；Fr.2-1组分经RP-18柱层析，20%-90%的甲醇/水梯度洗脱，得到2个亚组分Fr.2-1-1和Fr.2_1_2，其中Fr.2-1-1经0DSHPLC制备柱纯化，27%乙腈和4%。三氟乙酸为洗脱剂，得到RA-1 (3)，RA-XI (4) ；Fr.2+2经ODSHPLC制备柱纯化，23%乙腈和4%。三氟乙酸为洗脱剂，得到RA-XII (5)；Fr.3组分经硅胶柱层析,20:1-8:2的氯仿/甲醇梯度洗脱，富集含环肽部位经Sephadex LH-20层析,1:1的氯仿/甲醇为洗脱剂，合并含环肽部位Fr.3-1 ；Fr.3-1组分经ODS HPLC制备柱纯化，20%乙腈和4%。三氟乙酸为洗脱剂，得到RY-1I (S)0
6.权利要求1中的茜草科类型环肽联合一种或多种附加的疗法如放射疗法，或化疗法如顺钼、卡钼、长春新碱、紫杉醇、环磷酰胺、阿霉素化疗，或联合抗体药、外科手术和/或联合一种或多种其它药物在制备治疗与预防Hedgehog信号通路异常激活的相关癌症的药物中的应用，所述的癌症为基底细胞癌、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤、痣样基底细胞癌综合征、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、转移性前列腺癌、胰腺癌、软骨肉瘤、骨肉瘤、黑色素瘤、神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管癌、肝癌、膀胱癌、血管瘤、慢性髓细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤。
【文档编号】A61K38/12GK103877562SQ201410133341
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年4月3日 优先权日:2014年4月3日
【发明者】谭宁华, 毛炳宇, 赵思蒙, 江世友 申请人:中国科学院昆明植物研究所, 中国科学院昆明动物研究所