1-Cre:Pkd2f3/f3小鼠是利用Cre_loxP系统建立的可以条件性敲除Pkd2的小鼠模型，可产生与人类常染色体显性遗传性多囊肾(Autosomal Dominant Polycystic KidneyDisease, ADPKD)类似临床表型，并早期死于肾衰竭，可作为ADPKD动物模型。其构建及鉴定过程如下:
[0043]一、Vil-Cre:Pkd2f3/f3 小鼠模型的构建
[0044]将Pkd2f3/f3小鼠与带有Vil-Cre重组酶的转基因小鼠(B6.SJL-Tg (Vil-cre) 997Gum/J)进行杂交，得到F1代(理论上有1/2后代的基因型为Vi 1-Cre:Pkd2+/f3 ；1/2 后代的基因型为 Pkd2+/f3);将 F1 代中 Vi 1-Cre:Pkd2+/f3 小鼠(针对Cre基因进行PCR鉴定，具体方法参见下文，经鉴定得到大小为650bp目的条带的F1代小鼠)与Pkd2f3/f3小鼠进行回交，得到回交后代。
[0045]从以上所得回交后代中，筛选得到Pkd2基因纯合，同时可表达Vil-Cre的小鼠，具体操作如下:
[0046]提取回交后代鼠尾基因组，以其为模板，分别对Pkd2基因以及Cre基因进行PCR鉴定，其中针对Pkd2基因的PCR所用引物序列为如下三条:5’-TCT GAC TTG CAG ACT GTGGG-3’，5’-AGG TAG GGG AAG GTC AGG GTT GG-3’，5’-TTTACGTCCAGCCAAGCT-3’ ；针对(:代基因的PCR所用引物序列为如下两条:5’-CCA GGT TAC GGA TAT AGT TCA TG_3，，5，_TGC CACGAC CAA GTG ACA GC_3’。当采用针对Pkd2基因的三条引物在同一反应体系中进行PCR扩增时，如果得到大小分别为650bp和350bp的两个条带，则对应的回交后代小鼠为Pkd2基因杂合(Pkd2+/f3)，如果得到大小为650bp的单一条带，则对应的回交后代小鼠为Pkd2基因纯合(Pkd2f3/f3);当采用针对Cre基因的两条引物进行PCR扩增时，如果得到大小为650bp的目的条带，则对应的回交后代小鼠表达Vil-Cre，如果没有得到大小为650bp的目的条带，则对应的回交后代小鼠不表达Vi 1 -Cre。
[0047]结果如图1所示，图1中A中的Pkd2f3/f3为Pkd2基因纯合，图1中B中的Vil-Cre为可表达Vil-Cre。经过以上鉴定，从回交后代中得到的Pkd2基因纯合，同时可表达Vil-Cre的小鼠，即为Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠。Vil_Cre为受控于Villinl启动子的Cre酶，其中villinl启动子表达于小鼠胚胎期第12.5天的肠上皮细胞，小鼠在Cre酶的作用下，可在细胞水平上产生Pkd2d3/d3，由于Pkd2d3/d3等位基因上的3号外显子已被剪切掉，进而产生移码突变，导致3号外显子下游不远处产生终止子，进而使Pkd2基因产物PC2成为截断蛋白。
[0048]二、Vil-Cre:Pkd2f3/f3 小鼠模型的鉴定
[0049]常规饲养步骤一得到的Vi 1-Cre: Pkd2f3/f3小鼠，观察其存活状态。待小鼠四月龄，取其肾脏、肝脏、胰腺，观察病变情况；另外对肾脏进行HE染色分析(具体操作参见实施例2相关步骤)。同时设置Pkd2f3/f3小鼠作为对照。
[0050]结果显示:步骤一得到的Vi 1-Cre:Pkd2f3/f3小鼠在第4?5月左右死亡，其肾脏、肝脏、胰腺均出现严重的囊肿，而且肾脏的HE染色结果进一步表明肾脏无肾实质，肾功能严重受损，判定Vil-Cre:Pkd2f3/fM、鼠死于肾囊肿导致的肾衰竭，而同窝同龄的Pkd2f3/fM、鼠则表型正常。具体结果如图2所示。[0051 ] 以上结果表明，步骤一得到的Vi 1-Cre: Pkd2f3/f3小鼠表型与人类ADPKD患者相似，可作为ADPKD动物模型。
[0052]实施例2、XAV939在治疗常染色体显性遗传性多囊肾中的应用
[0053]本实施例以Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠作为ADPKD动物模型，研究分析XAV939在治疗常染色体显性遗传性多囊肾中的应用。具体如下:
[0054]一、实验方法
[0055]1、实验分组及处理
[0056]XAV939溶液:将XAV939用DMS0溶解，至其浓度为12mg/mL，后用生理盐水稀释至5mg/mlο
[0057]分组及处理:分为治疗组和对照组，每组至少20只Vi 1-Cre:Pkd2f3/f3小鼠。从小鼠出生后第十天开始，进行连续一周的皮下注射，后改为腹腔注射，每天给药直至小鼠两月龄停药，治疗组每只小鼠按50mg/kg (每kg体重给50mg XAV939)的剂量给药；对照组每只小鼠每天注射等体积的含有等量DMS0的生理盐水。
[0058]2、各组小鼠治疗情况分析
[0059](1)HE染色分析两组小鼠的肾囊肿表型
[0060]在小鼠两月龄停药后，每组随机选取不少于10只小鼠，处死后，摘除双侧肾脏。在电子天平上精确称重，计算肾脏体重比(g/g)，即双侧肾脏重量(g)/体质量(g)。后将双侧肾脏沿着矢状面切开，用10%中性福尔马林溶液固定24小时，后梯度乙醇脱水，然后用石蜡包埋机常规包埋，蜡块待后行切片及HE染色。
[0061]A.脱水包埋
[0062]具体步骤:①脱水:70%乙醇lh — 75%乙醇lh — 80%乙醇lh — 85%乙醇lh — 90%乙醇lh — 95%乙醇lh — 100%乙醇lh — 二甲苯15minX2 ;②包埋:石蜡包埋机进行包埋。
[0063]B.切片
[0064]将肾脏蜡块在轮转式切片机上做成3 μ m厚度的连续肾组织切片，用毛笔轻轻扶起，在温水中将其充分展开，再用多聚赖氨酸处理过的玻片捞起肾组织切片，电热干燥机烤干，然后放于电热恒温鼓风干燥箱里中，70°C恒温烘烤1小时，以使组织切片与玻片紧密粘连，直于盒中备用。
[0065]C.HE病理染色
[0066]原理:苏木精(hematoxylin)染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红(eosin)为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
[0067]步骤:
[0068]①二甲苯脱蜡，后用100%乙醇洗去；
[0069]②不同浓度的乙醇依次水化；
[0070]③磷酸缓冲液摇床缓洗5分钟；
[0071]④苏木精浸提8次；
[0072]⑤流水冲洗5分钟；
[0073]⑥盐酸酒精浸提8次；
[0074]⑦流水冲洗2分钟；
[0075]⑧伊红染色10分钟；
[0076]⑨不同浓度的乙醇依次脱水；
[0077]⑩二甲苯透明，后用中性树胶封片；显微镜观察。
[0078](11)结果显示:细胞浆红色，细胞核蓝紫色。
[0079](2)两组小鼠的肾脏囊肿指数的测定
[0080]两组小鼠HE染色的肾脏切片拍照后，图片运行于GNU Image Manipulat1nProgram。首先将图片转换为灰度图，然后调整图片像素至800X 598。将调整后的图片运行添加网格程序，设定每个网格为大小为22X22像素。计算囊肿区域网格数量和肾脏区域总网格数量比例即可得到囊肿指数。
[0081 ] (3)两组小鼠ADPKD相关生化指标的测定
[0082]本发明的发明人为了准确反应出治疗组小鼠肾肝功能的改善程度，进一步对两组小鼠血液中尿素氮(BUN)与肌酐(CRE)的含量进行了测定，以此确切反应肾功能的变化情况，反映出囊肿的严重程度。具体操作如下:
[0083]在小鼠两月龄时，将实验组及对照组小鼠乙醚麻醉，从下腔静脉抽取小鼠血液，离心后获取上清即为血清。对血清进行化验即可测得肌酐及尿素氮含量。
[0084]二、实验结果
[0085]1、两组小鼠的肾囊肿表型
[0086]HE染色结果如图3所示，从图中可以看出，治疗组较对照组具有更多的肾实质，且治疗组小鼠的肾囊肿表型明显少于对照组。另外，对治疗组与对照组小鼠的肾脏体重比(g/g)测定结果如图4所示，结果显示治疗组的肾脏体重比(g/g)显著小于对照组(p =0.00001)，具有统计学意义。
[0087]2、两组小鼠的肾脏囊肿指数
[0088]两组小鼠的肾脏囊肿指数测定结果如图5所示，治疗组较对照组相比肾脏囊肿指数显著降低(P = 0.00002)，具有统计学意义。
[0089]3、两组小鼠ADPKD相关生化指标的测定
[0090]两组小鼠的血液中尿素氮(BUN)与肌酐(CRE)的含量测定结果如图6所示，结果显示，治疗组小鼠的血液中尿素氮(BUN)与肌酐(CRE)的含量较对照组相比，均有下降趋势，治疗组的血液中尿素氮显著小于对照组(P = 0.0015)，具有统计学意义。
[0091]综合本实施例的实验结果，可见XAV939在治疗常染色体显性遗传性多囊肾(ADPKD)中具有一定作用。
【主权项】
1.ffnt信号通路抑制剂在制备治疗常染色体显性遗传性多囊肾的产品中的应用。2.ffnt信号通路抑制剂在制备如下任一产品中的应用: (1)减弱患病机体肾囊肿程度的产品； (2)降低患病机体肾脏体重比的产品； (3)降低患病机体的肾脏囊肿指数的产品； (4)降低患病机体血液中肌酐和/或尿素氮含量的产品。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于:所述Wnt信号通路抑制剂为XAV939。4.一种产品，其活性成分为Wnt信号通路抑制剂；所述产品的用途为如下中的至少一种: (a)治疗常染色体显性遗传性多囊肾； (b)减弱患病机体肾囊肿程度； (c)降低患病机体肾脏体重比； (d)降低患病机体的肾脏囊肿指数； (e)降低患病机体血液中肌酐和/或尿素氮含量。5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于:所述Wnt信号通路抑制剂为XAV939。6.根据权利要求2-5中任一所述的应用或产品，其特征在于:所述患病机体为具有常染色体显性遗传性多囊肾临床症状的机体。7.根据权利要求1-6中任一所述的应用或产品，其特征在于:所述产品为药物。
【专利摘要】本发明公开了一种Wnt信号通路抑制剂的新用途。本发明所提供的Wnt信号通路抑制剂的新用途具体为Wnt信号通路抑制剂在制备治疗常染色体显性遗传性多囊肾(ADPKD)的产品中的应用；所述Wnt信号通路抑制剂具体为XAV939。本发明以Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠作为ADPKD动物模型，结果表明Wnt信号通路抑制剂—XAV939可减弱Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠的肾囊肿程度，可降低Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠的肾脏体重比，可降低Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠的肾脏囊肿指数，可降低Vil-Cre:Pkd2f3/f3小鼠的血液中肌酐和尿素氮的含量。本发明对于ADPKD发病机制的分析，对于治疗ADPKD的药物的研发均具有重要意义。
【IPC分类】A61K31/519, A61P13/12
【公开号】CN105343096
【申请号】CN201410409530
【发明人】吴冠青, 李奥, 李渊
【申请人】北京仕林伟业生物科技有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2014年8月19日