一种结核分枝杆菌erp 12基序突变为pglts的重组质粒pegfp-12的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，涉及一种结核分枝杆菌ERP 12基序突变为PGLTS 的重组质粒PEGFP-12。
【背景技术】
[0002] 牛结核病是一种慢性消耗性传染病，影响动物的奶、肉以及家畜产品的产出，造成 了严重的经济损失。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis)是引起牛结核病的主 要致病菌，其致病性与细菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎症、菌体成分和代谢物质的毒 性以及机体对菌体成分产生的免疫损伤有关。
[0003] Erp (exported repeated protein)，也称为 P36, Pirg 或 Rv3810,是结核分枝杆菌 的一种重要毒力因子，erp存在于结核分枝杆菌复合体所有成员（结核分枝杆菌、牛型结核 分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡介苗和田鼠分枝杆菌）中，也存在于麻风病致病菌麻风分枝杆 菌，但是后来的研宄证明，在耻垢分枝杆菌和机会性致病结核分枝杆菌（鸟型分枝杆菌、海 分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌和溃疡分枝杆菌）中也检测到了该基因的表达。而在其它的细菌 种内没有发现同族体，使得Erp成为结核分枝杆菌家族的一个特异信号分子。
[0004] erp全长284个氨基酸，由三个不同的区域组成，N-末端（1-80AA)包含22个氨基 酸的信号肽，引导蛋白质在细胞内的运输；中心是基于PGLTS基序的12个重复区，其中前3 个基序严格保守；C-末端（176-284AA)包含富含脯氨酸和丙氨酸的疏水性区域。中间重复 区具有一定的可变性，其主要体现在两方面。首先，重复区的绝对数是可变的，如麻风分枝 杆菌的PGLTS重复区是4、结核分枝杆菌是12、而耻垢分枝杆菌是21。其次，PGLTS重复区 的序列是可变的。在一些种间，如耻垢分枝杆菌和蟾蜍分枝杆菌有一半的重复区是错配的。 Erp蛋白的N-端、中间重复序列以及C-末端对于蛋白质的功能有很重要的作用，但是具体 的分子机制尚属未知，特别是中间的重复序列的PGLTS的保守性与功能的关系目前尚未研 宄。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种结核分枝杆菌ERP 12 基序突变为PGLTS的重组质粒PEGFP-12,首先合成了中间重复序列完全突变为PGLTS保守 序列，并构建其真核表达载体PEGFP-12,并将该载体与ERP野生型载体PEGFP-ERP分别转染 人肺泡上皮II型细胞一一A549,之后通过蛋白芯片检测转染后细胞相关因子的变化，为研 宄PGLTS基序突变与功能关系提供有力数据。
[0006] 其具体技术方案为：
[0007] -种结核分枝杆菌ERP 12基序突变为PGLTS的重组质粒PEGFP-12,根据结核分 枝杆菌野生型ERP的序列，合成出12基序完全突变为PGLTS的ERP完整序列，并进行人源 化优化，构建到PEGFP-Nl真核生物表达载体上，并命名为PEGFP-12。突变后的序列如SEQ : ID :N0 :1 所示。
[0008] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0009] 本发明将该载体转化到大肠杆菌中大提质粒，将质粒用脂质体转染法转到A549 细胞中，然后做蛋白芯片检测，看转染后与野生型相比，细胞因子变化情况，为研宄PGLTS 基序突变与功能关系提供有力数据。本发明构建了结核分枝杆菌ERP的12基序突变为 PGLTS的基因重组质粒，将质粒用脂质体转染法转到A549细胞中，然后做蛋白芯片检测，并 与野生型ERP序列相比较，发现基序完全突变为12个PGLTS之后引起细胞细胞炎性相关因 子表达明显上调，说明突变后能够引起更明显的炎性反应，为研宄PGLTS基序突变与功能 关系提供有力数据。
【附图说明】
[0010] 图 1 是转染 pEGFP-Erp-1224hA549 细胞（200X);
[0011] 图 2 是转染 pEGFP-Erp-1224hA549 细胞（200 X)。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0013] 由上金斯瑞生物科技公司合成出12基序完全突变为PGLTS的ERP完整序列，并进 行人源化优化，构建到PEGFP-Nl真核生物表达载体上，克隆位点为Hindlll/PstI，并命名 为PEGFP-12。突变后的序列如SEQ :ID :NO :1所示。
[0014] 将该载体转化到大肠杆菌中大提质粒，将质粒用脂质体转染法转到A549细胞中， 然后做蛋白芯片检测，看转染后与野生型相比，细胞因子变化情况，为研宄PGLTS基序突变 与功能关系提供有力数据。
[0015] PEGFP-12与PEGFP-ERP重组质粒分别转染A549细胞如图1、图2所示。将重组质 粒转化到大肠杆菌DH5 α中进行扩增，提取重组质粒PEGFP-Erp-12与pEGFP-Nl空载体分 别转染到A549细胞株中，利用荧光显微镜观察，证实了 Erp基因在A549中成功表达，转染 效率达到了 80%。
[0016] PET28a-GFP-12与PET28A-GFP-ERP重组质粒分别转染A549细胞，后通过蛋白芯 片检测细胞因子的变化的数据比较如表1所示：表1为PET28a-GFP-12与PET28A-GFP-ERP 重组质粒转染A549细胞，通过蛋白芯片检测细胞因子的表达量。
[0017] 表 1
[0018]
【主权项】
1. 一种结核分枝杆菌ERP 12基序突变为PGLTS的重组质粒PEGFP-12,其特征在于， 根据结核分枝杆菌野生型ERP的序列，合成出12基序完全突变为PGLTS的ERP完整序 列，并进行人源化优化，构建到PEGFP-Nl真核生物表达载体上，并命名为PEGFP-12,突变后 的序列如SEQ :ID :N0 :1所示。
【专利摘要】本发明公开了一种结核分枝杆菌ERP 12基序突变为PGLTS的重组质粒PEGFP-12，根据结核分枝杆菌野生型ERP的序列，合成出12基序完全突变为PGLTS的ERP完整序列，并进行人源化优化，构建到PEGFP-N1真核生物表达载体上，并命名为PEGFP-12。突变后的序列如SEQ：ID：NO：1所示。本发明构建了结核分枝杆菌ERP的12基序突变为PGLTS的基因重组质粒，将质粒用脂质体转染法转到A549细胞中，然后做蛋白芯片检测，并与野生型ERP序列相比较，发现基序完全突变为12个PGLTS之后引起细胞炎性相关因子表达明显上调，说明突变后能够引起更明显的炎性反应，为研究PGLTS基序突变与功能关系提供有力数据。
【IPC分类】C12N15-85
【公开号】CN104862334
【申请号】CN201510309809
【发明人】王玉炯, 李敏, 郝秀静, 何玉龙, 马臣杰
【申请人】宁夏大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年6月3日