一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基的制备方法及使用该培养基快速鉴别结核分枝杆菌的方法、测定结核分枝杆菌对抗结核药的耐药性方法及使用该培养基中的液体培养基快速培养卡介苗的方法。本发明制备的双相培养基能用于结核分枝杆菌的快速培养，双相快速培养基能在2-5天鉴别出结核分枝杆菌，并且可利用反转录PCR方法对鉴别出的结核分枝杆菌进行利福平、异烟肼、链霉素抗结核药的耐药性检测，本发明制备的液体培养基可在6-9天完成卡介苗的培养。
【专利说明】—种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细菌培养与疫苗制备领域。具体涉及一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基的制备方法及使用该培养基快速鉴别结核分枝杆菌的方法、测定结核分枝杆菌对抗结核药的耐药性方法及使用该培养基中的液体培养基快速培养卡介苗的方法。
【背景技术】
[0002]结核分枝杆菌俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。估计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。据WHO报道，全世界约每3个人中就有I个人感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80%，其中约5%~10%携带者可发展为活动性结核病。目前全球每年约出现8百万结核新病例，并导致约3百万人死亡。中国每年死于结核病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多。通常对儿童采取接种卡介苗来预防结核病的发生，在临床上，只有快速鉴别出结核分枝杆菌，并对其进行培养，才能进一步找到对结核分枝杆菌有效的药物，因此要求提高结核分枝杆菌的鉴别速度，并且要尽量避免培养过程中存在的细菌污染问题。
[0003]长期以来我国一直采用罗氏培养基进行培养，培养成功需I个月以上，目前的培养卡介苗(BCG)培养基与培养方法严重滞后。由于结核分枝杆菌的快速培养、鉴定以及卡介苗(BCG)的制备对于结核病的确诊和治疗及结核病的预防具有重要的作用，因此迫切需要进行快速培养BCG和结核分枝杆菌的培养基。
[0004]结核分枝杆菌培养所用时间较长，原因是无论使用现在的固体培养基或液体培养基均不能及时给结核分枝杆菌提供生长所需营养物质，固体培养基的营养物质需不断扩散到表面，才能被结核分枝杆菌吸收，这样营养物质提供的速度决定了结核分枝杆菌增殖的速度；液体培养基在培养初期能较快的提供营养物质，但随着培养的进行，营养物质被不断消耗，从而影响结核分枝杆菌的增殖速度。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基的制备方法及使用该培养基快速鉴别结核分支杆菌的方法、测定结核分枝杆菌对抗结核药的耐药性方法及使用该培养基中的液体培养基快速培养卡介苗的方法。本发明用于解决当前结核分枝杆菌培养鉴别时间长，疫苗生产时间长的问题。
[0006]实现本发明上述目的所采用的技术方案为:
一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基，培养基的制备方法如下:
(I)固体培养基的制备:
a.称取盐酸吡卩多醇I~5mg、谷氨酸钠180~220mg、氯化钙10~20mg、硫酸镁15~25mg、柠檬酸铁铵80~120mg、柠檬酸钠180~220mg、硫酸铵380~420mg、丙酮酸钠950~1050mg、氯化铜I~10mg、氯化锌I~10mg、天门冬素1950~2050mg、磷酸二氢钾15~25mg和憐酸二氢钠15~25mg溶于蒸懼水600~700ml中，121°C加热15~20分钟，冷却至20-25°C，得到固体培养基基础液；
b.称取中性甘油8ml、1%孔雀绿水溶液15ml和鸡卵液1000ml加入步骤a所得固体培养基基础液中，混合均匀，分装于无菌培养管内，每管7~IOml ；
c.将b步骤所得无菌培养管于80~90°C加热10~20分钟，冷却，得到固体培养基，将固体培养基于4°C保存备用
(2)液体培养基的制备:
a.称取氯化韩I~10mg、硫酸镁5~15mg、油酸15~20mg、枸橼酸铁铵5~15mg、枸橼酸钠5~lOOmg、硫酸铵180~220mg、氯化铜I~10mg、氯化锌5~15mg、丙酮酸钠400~500mg、吐温-80 0.5~1ml、天门冬素950~1050mg、憐酸二氧钟950~1050mg和憐酸二氧钠1750~1850mg溶于蒸馏水450~600ml中，121°C加热15~20分钟，冷却至20-25°C,得到液体培养基基础液；
b.称取盐酸吡卩多醇0.15g、甘油5ml、酵母浸液4ml、过氧化氢酶0.2g、生物素0.15g、聚氧乙烯硬脂酸酯0.6g、牛血清白蛋白200g、酪蛋白消化物2g和分枝杆菌培养上清液5ml加入马铃薯汁500ml中，混合均匀，过滤除菌，得到促生长因子混合液；
c.将步骤a所得液体培养基基础液与步骤b所得促生长因子混合液按体积比1:1混合均匀，得液体培养基混合液，向其中添加过滤除菌后的抑菌剂，得到液体培养基；其中抑菌剂为多粘菌素B，氨苄青霉素和两性霉素B，且三者的质量与液体培养基混合液的质量体积比均为0.lmg/ml
(3)将步骤(2)所得液体培养基加入步骤(1)所得固体培养基中，液体培养基与固体培养基的体积比为1:1~1:3，得到结核分枝杆菌双相培养基；
(4)在结核分枝杆菌双相培养基液体中加入噻吩-2-羧酸肼0.1ml或对硝基苯甲酸
0.1ml，得到结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基。
[0007]本发明优选的方案是:固体培养基的制备中，制备步骤为:
a.称取盐酸批卩多醇lmg、谷氨酸钠200mg、氯化韩20mg>硫酸镁20mg、柠檬酸铁铵lOOmg、柠檬酸钠200mg、硫酸铵400mg、丙酮酸钠lOOOmg、氯化铜5mg、氯化锌5mg、天门冬素2000mg、磷酸二氢钾20mg和磷酸二氢钠20mg溶于蒸懼水650ml中，121°C加热18分钟,冷却至20°C，得到固体培养基基础液；
b.称取中性甘油8ml、1%孔雀绿水溶液15ml和鸡卵液1000ml加入步骤a所得固体培养基基础液中，混合均匀，分装于无菌培养管内，每管8ml ；
c.将步骤b所得无菌培养管于85°C加热15分钟，冷却，得到固体培养基，将固体培养基于4°C保存备用。
[0008]本发明优选的方案是:液体培养基的制备中，液体培养基基础液的制备步骤，具体如下:称取氯化韩5mg、硫酸镁10mg、油酸18mg、枸橼酸铁铵10mg、枸橼酸钠50mg、硫酸铵200mg、氯化铜5mg、氯化锌10mg、丙酮酸钠450mg、吐温-80 0.8ml、天门冬素lOOOmg、磷酸二氢钾1000mg和磷酸二氢钠1800mg溶于蒸馏水500ml中，121°C加热18分钟，冷却至20°C，
得到液体培养基基础液。
[0009]本发明还涉及将结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基用于结核分枝杆菌的快速鉴别并对鉴别出的结核杆菌进行利福平、异烟肼、链霉素抗结核药的耐药性测定；其中结核分枝杆菌的快速鉴别方法为:
A.将待鉴定菌配制成90-110个细菌/ml;
B.将待鉴定菌接种于结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基和结核分枝杆菌双相培养基上，每个培养基的接种量为10μ1，以结核分枝杆菌双相培养基为对照，得接种后的培养基；
C.将接种后的培养基置入37°C温箱中孵育2-5天，观察培养基液体中出现颗粒或培养基固体表面出现菜花样菌落，则待鉴定菌在培养基中生长；
D.待鉴定菌在噻吩-2-羧酸肼培养基中生长，在对硝基苯甲酸培养基中不生长，则为结核分枝杆菌，在含有噻吩-2-羧酸肼的培养基和对硝基苯甲酸的培养基中均不生长，则为非结核分枝杆菌。
[0010]对鉴别出的结核杆菌可同时进行利福平、异烟肼、链霉素抗结核药的耐药性测定，根据结核分枝杆菌耐药基因rpoB、katG、inhA、rrs、rpsL序列设计引物,反转录PCR检测结核分枝杆菌目的基因的mRNA，其中结核分枝杆菌利福平耐药基因为rpoB，异烟肼耐药基因为katG、inhA,链霉素耐药基因为rrs、rpsL,同时以传统药敏试验和DNA序法为对照；
所述的结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA、rrs、rpsL基因引物序列为:rpoB基因上游引物序列为:CCTAAGGTTGACGACGGACC，下游引物序列为:TCGACCAACAGCACGTCTAC，正常扩增长度:743bp ；
katG基因上游引物序列为:TCGTCCAGCCATTGACCATC，下游引物序列为:TCGACCAACAGCACGTCTA C，正常扩增长度:664bp ；
inhA基因上游引物序列为:CGGAATCATCACCGACTCGT，下游引物序列为:GCGTAGATGATGTCACCCGT，正常扩增长度:741bp ；
rrs基因上游引物序列为:ACTCGAAGGAATTGACGGGG，下游引物序列为:CCCAACATCTCACGACACGA，正常扩增长度:179bp ；
rpsL基因上游引物序列为:CACTCCGAAGAAGCCGAACT，下游引物序列为:GTTTGCGGTTCTTGACACCC,正常扩增长度:215bp。
[0011]本发明还涉及一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基的应用，其中的液体培养基用于卡介苗的快速培养，方法如下:
取100个细菌/ml的卡介苗?ομL接种于100mL液体培养基中，于38°C，150rpm恒温摇床振荡培养一天，36°C下恒温摇床振荡继续培养5-8天，每天观察现象，用紫外分光光度计测菌密度，当0D600为0.8时，停止培养，收集菌体，得到卡介苗。
[0012]本发明所提供的一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基的制备及其应用，与现有技术相比，具有以下优点:本发明制备的双相培养基可用于结核分枝杆菌的快速培养，在液体培养状态下得到细菌，在固体培养基上得到单菌落，得到单菌落有利于从形态上对结核分枝杆菌进行初步鉴定，并且能够进行后续的药敏实验。
[0013]本发明提供的液体培养基中含有细菌生长刺激剂酵母浸液、马铃薯汁，能大大提高结核分枝杆菌的生长和培养速度，因此，制备的液体培养基6-9天可完成卡介苗的培养，相比现有卡介苗的培养时间缩短了 I倍以上；本发明固体培养基含有的鸡卵液、丙酮酸钠、天冬门素等成分和液体培养基含有的马铃薯汁、酵母浸液等促生长因子均能使结核分枝杆菌快速增殖，并且将固体培养基和液体培养基混合使用，液体培养基的营养成分能被结核杆菌快速吸收，固体培养基的营养能扩散到表面，及时补充细菌增殖时消耗液体培养基的营养。固体培养基含有的孔雀绿和液体培养基含有的抑菌剂能有效防止杂菌污染，实验数据显示，普通培养基的污染率是2%，而该培养基的污染率仅为0.2%。
[0014] 双相培养基中加入噻吩-2-羧酸肼和对硝基苯甲酸对结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌进行鉴别，方法简单容易操作，能在2-5天鉴别出结核分枝杆菌，并且可利用反转录PCR方法测定结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、链霉素抗结核药的耐药性。
【具体实施方式】
[0015]本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基的制备方法及使用该培养基快速鉴别结核分枝杆菌的方法、测定结核分枝杆菌对抗结核药的耐药性方法及使用该培养基中的液体培养基快速培养卡介苗的方法。
[0016]一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基的制备方法如下:
(1)固体培养基的制备:
a.称取盐酸吡卩多醇I~5mg、谷氨酸钠180~220mg、氯化钙10~20mg、硫酸镁15~25mg、柠檬酸铁铵80~120mg、柠檬酸钠180~220mg、硫酸铵380~420mg、丙酮酸钠950~1050mg、氯化铜I~10mg、氯化锌I~10mg、天门冬素1950~2050mg、磷酸二氢钾15~25mg和憐酸二氢钠15~25mg溶于蒸懼水600~700ml中，121°C加热15~20分钟，冷却至20-25°C，得到固体培养基基础液；
b.称取中性甘油8ml、1%孔雀绿水溶液15ml和鸡卵液1000ml加入步骤a所得固体培养基基础液中，混合均匀，分装于无菌培养管内，每管7~IOml ；
c.将b步骤所得无菌培养管于80~90°C加热10~20分钟，冷却至20-25°C，得到固体培养基，将固体培养基于4°C保存备用；
所述鸡卵液为新鲜鸡卵液，具体的制备方法如下:选择不超过7天、中等大小的鸡蛋，洗净鸡蛋表面，浸泡在70%乙醇中25分钟，取出，拭干，开口，收集鸡卵液，搅拌均匀，通过消毒的纱布过滤得新鲜鸡卵液；
(2)液体培养基的制备:
a.称取氯化韩I~10mg、硫酸镁5~15mg、油酸15~20mg、枸橼酸铁铵5~15mg、枸橼酸钠5~lOOmg、硫酸铵180~220mg、氯化铜I~10mg、氯化锌5~15mg、丙酮酸钠400~500mg、吐温-80 0.5~1ml、天门冬素950~1050mg、憐酸二氧钟950~1050mg和憐酸二氧钠1750~1850mg溶于蒸馏水450~600ml中，121 °C加热15~20分钟，冷却至20-25°C,得到液体培养基基础液；
b.称取盐酸吡卩多醇0.15g、甘油5ml、酵母浸液4ml、过氧化氢酶0.2g、生物素0.15g、聚氧乙烯硬脂酸酯0.6g、牛血清白蛋白200g、酪蛋白消化物2g和分枝杆菌培养上清液5ml加入马铃薯汁500ml中，混合均匀，过滤除菌，得到促生长因子混合液；
所述的马铃薯汁，其制备方法为称取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，得马铃薯汁；
c.将步骤a所得液体培养基基础液与步骤b所得促生长因子混合液按体积比1:1混合均匀，得液体培养基混合液，向其中添加过滤除菌后的抑菌剂，得到液体培养基；
所述的抑菌剂为多粘菌素B、氨苄青霉素和两性霉素B，且三者的质量与液体培养基混合液的质量体积比均为0.lmg/ml ；(3)将步骤(2)所得液体培养基加入步骤(1)所得固体培养基中，液体培养基与固体培养基的体积比为1:1~1:3，得到结核分枝杆菌双相培养基；
(4)在结核分枝杆菌双相培养基液体中加入噻吩-2-羧酸肼0.1ml或对硝基苯甲酸
0.1ml，得到结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基。
[0017]本发明还涉及将结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基用于结核分枝杆菌的快速鉴别并对鉴别出的结核杆菌进行利福平、异烟肼、链霉素抗结核药的耐药性测定；
其中结核分枝杆菌的快速鉴别方法为:
A.将待鉴定菌配制成90-110个细菌/ml；
B.将待鉴定菌接种于结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基和结核分枝杆菌双相培养基上，每个培养基的接种量为10μ1，以结核分枝杆菌双相培养基为对照，得接种后的培养基；
C.将接种后的培养基置入37°C温箱中孵育2-5天，观察培养基液体中出现颗粒或培养基固体表面出现菜花样菌落，则待鉴定菌在培养基中生长；
D.待鉴定菌在噻吩-2-羧酸肼培养基中生长，在对硝基苯甲酸培养基中不生长，则为结核分枝杆菌，在含有噻吩-2-羧酸肼的培养基和对硝基苯甲酸的培养基中均不生长，则为非结核分枝杆菌。
[0018]对于长期服 药病人及原发后感染病人，有必要对其进行耐药性检测，以提高临床用药的疗效，本研究可成功对培养的结核杆菌进行利福平、异烟肼、链霉素抗结核药的耐药性测定，根据结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA、rrs、rpsL基因序列设计引物,反转录PCR检测结核分枝杆菌目的基因的mRNA，其中结核分枝杆菌利福平耐药基因为rpoB，异烟肼耐药基因为katG、inhA,链霉素耐药基因为rrs、rpsL,同时以传统药敏试验和DNA序法为对照；
所述的结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA、rrs、rpsL基因引物序列为:rpoB基因上游引物序列为:CCTAAGGTTGACGACGGACC，下游引物序列为:TCGACCAACAGCACGTCTAC，正常扩增长度:743bp ；
katG基因上游引物序列为:TCGTCCAGCCATTGACCATC，下游引物序列为:TCGACCAACAGCACGTCTAC,正常扩增长度:664bp ；
inhA基因上游引物序列为:CGGAATCATCACCGACTCGT，下游引物序列为:GCGTAGATGATGTCACCCGT，正常扩增长度:741bp ；
rrs基因上游引物序列为:ACTCGAAGGAATTGACGGGG，下游引物序列为:CCCAACATCTCACGACACGA，正常扩增长度:179bp ；
rpsL基因上游引物序列为:CACTCCGAAGAAGCCGAACT，下游引物序列为:GTTTGCGGTTCTTGACACCC,正常扩增长度:215bp。
[0019]一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基的应用，其中的液体培养基可用于卡介苗的快速培养，方法如下:
取100个细菌/ml的卡介苗10μ1接种于100mL液体培养基中，于38°C，150rpm恒温摇床振荡培养一天，36°C下恒温摇床振荡继续培养5-8天，每天观察现象，用紫外分光光度计测菌密度，当0D600为0.8时，停止培养，收集菌体，得到卡介苗。
[0020]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0021]实施例1
(I)固体培养基的制备:a.称取盐酸批卩多醇4mg、谷氨酸钠180mg、氯化韩15mg、硫酸镁25mg、柠檬酸铁铵90mg、柠檬酸钠200mg、硫酸铵380mg、丙酮酸钠950mg、氯化铜5mg、氯化锌5mg、天门冬素2000mg、磷酸二氢钾20mg和磷酸二氢钠25mg溶于蒸馏水700ml，121°C加热20分钟，冷却至21°C，得到固体培养基基础液；
b.称取中性甘油8ml、1%孔雀绿水溶液15ml和鸡卵液1000ml加入步骤a所得固体培养基基础液中，混合均匀，分装于无菌培养管内，每管IOml ；
c.将b步骤所得无菌培养管于90°C加热10分钟，冷却至20-25°C，得到固体培养基，将固体培养基于4°C保存备用；
(2)液体培养基的制备:
a.称取氯化韩5mg、硫酸镁5mg、油酸15mg、枸橼酸铁铵10mg、枸橼酸钠50mg、硫酸铵200mg、氯化铜10mg、氯化锌10mg、丙酮酸钠450mg、吐温-80 1ml、天门冬素950mg、磷酸二氢钾950mg和磷酸二氢钠1800mg溶于蒸馏水600ml中，121 °C加热20分钟，冷却至21 °C，得到
液体培养基基础液；
b.称取盐酸吡卩多醇0.15g、甘油5ml、酵母浸液4ml、过氧化氢酶0.2g、生物素0.15g、聚氧乙烯硬脂酸酯0.6g、牛血清白蛋白200g、酪蛋白消化物2g和分枝杆菌培养上清液5ml加入马铃薯汁500ml中，混合均匀，过滤除菌，得到促生长因子混合液；
c.取液体培养基基础液500ml加入步骤a所得液体培养基基础液500ml中，混合均匀，并向其中加入过滤除菌后的多粘菌素B 0.lg、氨苄青霉素0.1g和两性霉素B 0.lg，得到液体培养基；
(3)向每个步骤(1)制备的装有固体培养基的无菌培养管中加入步骤(2)所得液体培养基5ml，得到结核分枝杆菌双相培养基；
(4)在结核分枝杆菌双相培养基液体中加入噻吩-2-羧酸肼0.1ml或硝基苯甲酸
0.1ml，得到结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基。
[0022]将上述制备的结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基用于结核分支杆菌的快速鉴别:
取结核病患者的痰液样品，首先进行前处理，在离心管内加入样品，再加入样品广2倍的4%的氢氧化钠液漩涡振荡10秒后静置20分钟，成待鉴定菌，将待鉴定菌配置成大约100个细菌/ml ;将待鉴定菌接种于含有噻吩-2-羧酸肼结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基、含有对硝基苯甲酸结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基、含有噻吩-2-羧酸肼和对硝基苯甲酸的结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基、不含有噻吩-2-羧酸肼和对硝基苯甲酸的结核分枝杆菌双相培养基上，每个培养基的接种量均为ΙΟμΙ，其中结核分枝杆菌双相培养基为对照，得接种后的培养基；将接种后的培养基置37°C温箱中孵育4天后，在含有噻吩-2-羧酸肼培养基液体中出现颗粒，在含有对硝基苯甲酸培养基的液体中未出现颗粒并且该培养基固体表面未出现菜花样菌落，则判断该患者的痰液样品中含有结核分枝杆菌。
[0023]实施例2 液体培养基的制备:
a.秤取氯化韩5mg、硫酸镁10mg、油酸18mg、枸橼酸铁铵IOmg、枸橼酸钠50mg、硫酸铵200mg、氯化铜5mg、氯化锌10mg、丙酮酸钠450mg、吐温-80 0.75ml、天门冬素lOOOmg、磷酸二氢钾lOOOmg、磷酸二氢钠1800mg溶于蒸馏水500ml中，121 °C加热20分钟，冷却至22°C，得到液体培养基基础液；
b.称取盐酸吡卩多醇0.15g、甘油5ml、酵母浸液4ml、过氧化氢酶0.2g、生物素0.15g、聚氧乙烯硬脂酸酯0.6g、牛血清白蛋白200g、酪蛋白消化物2g和分枝杆菌培养上清液5ml加入马铃薯汁500ml，混合均匀，过滤除菌，得到促生长因子混合液；
c.取液体培养基基础液500ml加入步骤a所得液体培养基基础液500ml中，混合均匀，并向其中加入过滤除菌后的多粘菌素B 0.lg、氨苄青霉素0.1g和两性霉素B 0.lg，得到液体培养基；
将制备的液体培养基用于卡介苗的快速培养:取100个细菌/ml的卡介苗ΙΟμΙ接种于100mL液体培养基中，于38°C，150rpm恒温摇床振荡培养一天，36°C下恒温摇床振荡继续培养，每天观察现象，适时用紫外分光光度计测菌密度，当0D600为0.8时，停止培养，收集菌体，使用该培养基7天可以收集菌体，完成卡介苗的培养。
[0024]实施例3
(I)固体培养基的制备:
a.称取盐酸批卩多醇lmg、谷氨酸钠200mg、氯化韩20mg>硫酸镁20mg、柠檬酸铁铵lOOmg、柠檬酸钠200mg、硫酸铵400mg、丙酮酸钠lOOOmg、氯化铜5mg、氯化锌5mg、天门冬素2000mg、磷酸二氢钾20mg和磷酸二氢钠20mg溶于蒸懼水650ml中，121°C加热18分钟,冷却至20°C，得到固体培养基基础液； b.称取中性甘油8ml、1%孔雀绿水溶液15ml和新鲜鸡卵液1000ml加入步骤a所得固体培养基基础液中，混合均匀，分装于无菌培养管内，每管8ml，其中新鲜鸡卵液的制备方法同实施例1 ;
c.将b步骤所得无菌培养管斜置于加热器内，85°C加热15分钟，冷却，得到固体培养基，将所得固体培养基于4°C保存备用。
[0025](2)液体培养基的制备:
a.秤取氯化韩5mg、硫酸镁10mg、油酸18mg、枸橼酸铁铵IOmg、枸橼酸钠50mg、硫酸铵200mg、氯化铜5mg、氯化锌10mg、丙酮酸钠450mg、吐温-80 0.8ml、天门冬素lOOOmg、磷酸二氢钾1000mg和磷酸二氢钠1800mg溶于蒸馏水500ml中，121 °C加热18分钟，冷却至20°C，得到液体培养基基础液；
b.称取盐酸吡卩多醇0.15g、甘油5ml、酵母浸液4ml、过氧化氢酶0.2g、生物素0.15g、聚氧乙烯硬脂酸酯0.6g、牛血清白蛋白200g、酪蛋白消化物2g和分枝杆菌培养上清液5ml加入马铃薯汁500ml，混合均匀，过滤除菌，得到促生长因子混合液；
c.取液体培养基基础液500ml加入步骤a所得液体培养基基础液500ml中，混合均匀，并向其中加入过滤除菌后的多粘菌素B 0.lg、氨苄青霉素0.1g和两性霉素B 0.lg，得到液体培养基；
(3)向每个步骤(1)制备的装有固体培养基的无菌培养管中加入步骤(2)所得液体培养基4ml，得双相培养基；
(4)在步骤(3)制备的培养基液体中分别加入噻吩-2-羧酸肼0.1ml或硝基苯甲酸
0.1ml，得到结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基。
[0026]取结核病患者的脓液样品，首先进行前处理，在离心管内加入样品，再加入样品1~2倍的4%的氢氧化钠液漩涡振荡10秒后静置20分钟，成待鉴定菌，将待鉴定菌配置成大约100个细菌/ml ;将待鉴定菌接种于含有噻吩-2-羧酸肼结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基、含有对硝基苯甲酸结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基、含有噻吩-2-羧酸肼和对硝基苯甲酸的结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基、不含有噻吩-2-羧酸肼和对硝基苯甲酸的结核分枝杆菌双相培养基上，每个培养基的接种量均为10μ1，其中结核分枝杆菌双相培养基为对照，得接种后的培养基；将接种后的培养基置37°C温箱中孵育3天后，在含有噻吩-2-羧酸肼培养基液体中出现颗粒，在含有对硝基苯甲酸培养基的液体中未出现颗粒并且该培养基固体表面未出现菜花样菌落，则判断该患者的脓液样品中含有结核分枝杆菌。
[0027] 将制备的液体培养基用于卡介苗的快速培养方法如下:取100个细菌/ml的卡介苗ΙΟμΙ接种于100mL液体培养基中，于38°C，150rpm恒温摇床振荡培养一天，36°C下恒温摇床振荡继续培养，每天观察现象，适时用紫外分光光度计测菌密度，当0D600为0.8时，停止培养，收集菌体，使用该培养基6天可以收集菌体，完成卡介苗的培养。
[0028]测定结核分枝杆菌对利福平、异烟肼、链霉素抗结核药的耐药性，根据结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA、rrs、rpsL基因序列设计引物,反转录PCR检测结核分枝杆菌目的基因的mRNA，同时以传统药敏试验和DNA序法为对照；
结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA、rrs、rpsL基因引物序列为:
rpoB基因上游引物序列为:CCTAAGGTTGACGACGGACC，下游引物序列为:TCGACCAACAGCACGTCTAC，正常扩增长度:743bp ；
katG基因上游引物序列为:TCGTCCAGCCATTGACCATC，下游引物序列为:TCGACCAACAGCACGTCTAC，正常扩增长度:664bp ；
inhA基因上游引物序列为:CGGAATCATCACCGACTCGT，下游引物序列为:GCGTAGATGATGTCACCCGT，正常扩增长度:741bp ；
rrs基因上游引物序列为:ACTCGAAGGAATTGACGGGG，下游引物序列为:CCCAACATCTCACGACACGA，正常扩增长度:179bp ；
rpsL基因上游引物序列为:CACTCCGAAGAAGCCGAACT，下游引物序列为:GTTTGCGGTTCTTGACACCC，正常扩增长度:215bp ；
结果为60株结核分枝杆菌临床分离株中，20株药物敏感株扩增结果与标准株完全相同；40株耐利福平临床分离株均检测到基因突变。45株异烟肼耐药株中有41株检测到katG基因突变，4株检测到inhA突变，20株链霉素耐药株中，12株检测到rrs突变，8株检测到rpsL突变。与对照结果相同显示，用反转录PCR可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌分离株的rpoB、katG、inhA、rrs、rpsL基因突变,可用于临床耐药性的检测,指导临床用药。而传统的检测DNA误差大，时间长(因mRNA只有活的细菌才有，死亡的细菌仍就具有 DNA)。
【权利要求】
1.一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基，其特征在于:培养基的制备方法如下: (1)固体培养基的制备: a.称取盐酸吡卩多醇I~5mg、谷氨酸钠180~220mg、氯化钙10~20mg、硫酸镁15~25mg、柠檬酸铁铵80~120mg、柠檬酸钠180~220mg、硫酸铵380~420mg、丙酮酸钠950~1050mg、氯化铜I~10mg、氯化锌I~10mg、天门冬素1950~2050mg、磷酸二氢钾15~25mg和憐酸二氢钠15~25mg溶于蒸懼水600~700ml中，121°C加热15~20分钟，冷却至20-25°C，得到固体培养基基础液； b.称取中性甘油8ml、1%孔雀绿水溶液15ml和鸡卵液1000ml加入步骤a所得固体培养基基础液中，混合均匀，分装于无菌培养管内，每管7~IOml ； c.将b步骤所得无菌培养管于80~90°C加热10~20分钟，冷却至20-25°C，得到固体培养基，将固体培养基于4°C保存备用； (2)液体培养基的制备: a.称取氯化|丐I~10mg、硫酸镁5~15mg、油酸15~20mg、枸橼酸铁铵5~15mg、枸橼酸钠5~lOOmg、硫酸铵180~220mg、氯化铜I~10mg、氯化锌5~15mg、丙酮酸钠400~500mg、吐温-80 0.5~1ml、天门冬素950~1050mg、憐酸二氧钟950~1050mg和憐酸二氧钠1750~1850mg溶 于蒸馏水450~600ml中，121 °C加热15~20分钟，冷却至20-25°C,得到液体培养基基础液； b.称取盐酸吡卩多醇0.15g、甘油5ml、酵母浸液4ml、过氧化氢酶0.2g、生物素0.15g、聚氧乙烯硬脂酸酯0.6g、牛血清白蛋白200g、酪蛋白消化物2g和分枝杆菌培养上清液5ml加入马铃薯汁500ml中，混合均匀，过滤除菌，得到促生长因子混合液； c.将步骤a所得液体培养基基础液与步骤b所得促生长因子混合液按体积比1:1混合均匀，得液体培养基混合液，向其中添加过滤除菌后的抑菌剂，得到液体培养基； 所述的抑菌剂为多粘菌素B、氨苄青霉素和两性霉素B，且三者的质量与液体培养基混合液的质量体积比均为0.lmg/ml ； (3)将步骤(2)所得液体培养基加入步骤(1)所得固体培养基中，液体培养基与固体培养基的体积比为1:1~1:3，得到结核分枝杆菌双相培养基； (4)在结核分枝杆菌双相培养基液体中加入噻吩-2-羧酸肼0.1ml或对硝基苯甲酸0.1ml，得到结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基。
2.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基，其特征在于:固体培养基的制备: a.称取盐酸批卩多醇lmg、谷氨酸钠200mg、氯化韩20mg>硫酸镁20mg、柠檬酸铁铵100mg、柠檬酸钠200mg、硫酸铵400mg、丙酮酸钠lOOOrng、氯化铜5mg、氯化锌5mg、天门冬素2000mg、磷酸二氢钾20mg和磷酸二氢钠20mg溶于蒸懼水650ml中，121°C加热18分钟,冷却至20°C，得到固体培养基基础液； b.称取中性甘油8ml、1%孔雀绿水溶液15ml和鸡卵液1000ml加入步骤a所得固体培养基基础液中，混合均匀，分装于无菌培养管内，每管8ml ； c.将步骤b所得无菌培养管于85°C加热15分钟，冷却，得到固体培养基，将固体培养基于4°C保存备用。
3.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基，其特征在于:液体培养基的制备中，液体培养基基础液的制备步骤，具体如下:称取氯化钙5mg、硫酸镁10mg、油酸18mg、枸橼酸铁铵10mg、枸橼酸钠50mg、硫酸铵200mg、氯化铜5mg、氯化锌10mg、丙酮酸钠450mg、吐温-80 0.8ml、天门冬素lOOOmg、磷酸二氢钾1000mg和磷酸二氢钠1800mg溶于蒸馏水500ml中，121°C加热18分钟，冷却至20°C，得到液体培养基基础液。
4.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基的应用，其特征在于:结核分枝杆菌的快速鉴别并对鉴别出的结核杆菌进行利福平、异烟肼、链霉素抗结核药的耐药性测定； 结核分枝杆菌的快速鉴别方法为: A.将待鉴定菌配制成90-110个细菌/ml； B.将待鉴定菌接种于结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基和结核分枝杆菌双相培养基上，每个培养基的接种量为10μ1，以结核分枝杆菌双相培养基为对照，得接种后的培养基； C.将接种后的培养基置于37°C温箱中孵育2-5天，观察培养基液体中出现颗粒或培养基固体表面出现菜花样菌落，则待鉴定菌在培养基中生长； D.待鉴定菌在噻吩-2-羧酸肼培养基中生长，在对硝基苯甲酸培养基中不生长，则为结核分枝杆菌，在含有噻吩-2-羧酸肼的培养基和对硝基苯甲酸的培养基中均不生长，则为非结核分枝杆菌； 对鉴别出的结核杆菌可同时进行利福平、异烟肼、链霉素抗结核药的耐药性测定，根据结核分枝杆菌耐药基因rpoB、katG、inhA、rrs、rpsL序列设计引物,反转录PCR检测结核分枝杆菌目的基因的mRNA，其中结核分枝杆菌利福平耐药基因为rpoB，异烟肼耐药基因为katG、inhA,链霉素耐药基因为rrs、rpsL ； 所述的结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA、rrs、rpsL基因引物序列为:rpoB基因上游引物序列为:CCTAAGGTTGACGACGGACC，下游引物序列为:TCGACCAACAGCACGTCTAC，正常扩增长度:743bp ； katG基因上游引物序列为:TCGTCCAGCCATTGACCATC，下游引物序列为:TCGACCAACAGCACGTCTAC,正常扩增长度:664bp ； inhA基因上游引物序列为:CGGAATCATCACCGACTCGT，下游引物序列为:GCGTAGATGATGTCACCCGT，正常扩增长度:741bp ； rrs基因上游引物序列为:ACTCGAAGGAATTGACGGGG，下游引物序列为:CCCAACATCTCACGACACGA，正常扩增长度:179bp ； rpsL基因上游引物序列为:CACTCCGAAGAAGCCGAACT，下游引物序列为:GTTTGCGGTTCTTGACACCC,正常扩增长度:215bp。
5.如权利要求1所述的一种结核分枝杆菌双相快速鉴别培养基的应用，其特征在于:权利要求1的液体培养基用于卡介苗的快速培养，方法如下: 取100个细菌/ml的卡介苗?ομL接种于100mL液体培养基中，于38°C，150rpm恒温摇床振荡培养一天，36°C下恒温摇床振荡继续培养5-8天，每天观察现象，用紫外分光光度计测菌密度，当0D600为0.8时，停止培养，收集菌体，得到卡介苗。
【文档编号】C12Q1/68GK103993065SQ201410241566
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年6月3日 优先权日:2014年5月7日
【发明者】薛庆节, 闫迎春, 聂尚丹, 李秀真, 章洪华, 杨媛媛, 胡文洁 申请人:济宁医学院