用于检测油菜菌核病菌的方法和培养基的制作方法
【专利摘要】本发明提供了3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷或其含亚氨基噻唑烷结构的衍生物用于特异性地检测油菜菌核病菌的方法和培养基。在含有0.1～100.0μg/mL该类检测试剂的培养基摇瓶或平板中能特异性地诱导油菜菌核病菌的菌丝体内产生显著的绿色色素，具有特异性强、灵敏性和稳定性高的特点。绿色菌丝体用90%乙醇超声浸提，再用0.1M?HCl调节至pH3.0，即可获得绿色色素，该色素在波长为610-630nm区域内有特征吸收峰。该类检测试剂对油菜菌核病还具有一定的防控作用。
【专利说明】用于检测油菜菌核病菌的方法和培养基
【技术领域】
[0001]本申请涉及植物保护、生物技术、农药学等领域，尤其是植物保护领域。具体而言，本申请涉及农林植物菌核病菌的检测试剂及其检测方法。
【背景技术】
[0002]菌核病菌是危害油菜等十字花科、菊科、豆科、茄科、伞形花科、锦葵科等72科400种植物的重要农业病害。在长江中、下游及东南沿海主要油菜产区，包括江苏、安徽、上海、浙江、湖南、湖北、江西等地发生尤为突出，并已成为油菜的主要病害之一，严重影响了我国油料作物的生产。
[0003]该病菌主要以菌核在土壤、种子和病茎中越夏越冬。土壤中的菌核至少可存活7年。越夏菌核在秋季有少量萌发，产生子囊盘或菌丝侵染油菜幼苗。大多数菌核越夏越冬后，至翌年2-3月才萌发，主要产生子囊盘，51天后成熟，释放大量子囊孢子。条件不适宜，子囊孢子不会萌发，可存活一段时间，子囊孢子在田间的存活时间与气候条件有密切关系，特别是温度与水势。萌发后主要侵染油菜即将凋萎的花瓣和花药。子囊孢子萌发生出芽管，其顶端生出附着胞，附着胞的顶部形成侵染栓，通过角质层以机械压力直接侵入寄主，在角质层与表皮细胞之间 形成扁平的颗粒的泡囊，泡囊放射状地长出侵染菌丝向细胞间伸展。被菌丝侵染后，细胞壁间的果胶层发生改变，积累大量液体和水，细胞渗透性和酶也发生变化。通过菌丝扩展至茎枝，菌丝也可通过枝叶接触再侵染近旁植株，最后在感染部位表面、茎髓、角果内形成新菌核。菌核可随排水沟或田间灌溉水流传播，在流水中可存活10-21天，混入种子或土中越夏越冬。
[0004]传统的检测方法如:应用分离培养、生物测定、血清学等技术等作为检测手段，但这些检测技术不但耗时而且昂贵，检测的结果也不够可靠。如在对病原菌分离鉴定出了耗费时间过长，而且由于所使用的培养条件，如培养基、温度、PH值、培养时间的不一致性，往往造成鉴定上常有因个人主观认定的不同而衍生出很多困扰，因而对农业上的指导有限。而早期ELISA检测由于植物病原菌的低免疫原性以及植物提取物中的抑制物质，给植物病原菌的检测带来较大的困难，虽然目前一些病原菌重组结构已经用于血清学检测，但只有少数被用于常规的ELISA检测。目前在植物病原菌的检测方法中使用较多的是分子生物学方法，如PCR-RFLP及PCR-SSCP技术，如Jansen和Wetze等就开始应用IC-RT-PCR检测了几种侵染水果树的病毒，只要病毒浓度在10-100fg/ml之间，TMV或者ToMv这两种病毒就能被检测到，而且还能扩增出各自的分离物。Bertolini等报道了利用多聚RT-PCR能同时检测到侵染橄榄树的Cucumovirus,不仅能够保证检测的准确性,更能大大地提高检测效率。
[0005]有关菌核病菌检测诊断的报道较少。李红霞等发现通过PCR扩增和ThaI酶能直接检测油菜菌核病菌的多菌灵抗性和敏感菌株，结果与传统菌落直径法相吻合，而后根据菌核病菌β_微管蛋白基因的突变位点设计了 2对等位基因特异性寡核苷酸，直接以菌核的基因组DNA为模板扩增，所需时间约为6h，抗药性检出率为100%，与传统菌丝直径法的测定结果相比检测准确率为96%，而传统的检测方法至少需要1-2周。但此方法也有缺陷。如聚合酶的类型、缓冲液的组成、dNTP浓度、起始模板的纯度以及PCR扩增参数等均可以影响到结果的准确性。对于常规PCR而言，在RNA或者DNA的初提物中通常会含有高浓度的酚类化合物以及多糖类化合物，在一定条件下这些化合物会抑制聚合酶活性，因而降低了检测的灵敏性和精确度，还会造成假阴性的结果。另外由于引物设计不合适、靶序列或扩增产物的交叉污染等造成非特异性扩增带、片状拖带或涂抹带等。此外，利用PCR技术检测植物病原菌，需要耗费大量的实验材料和繁重的实验操作，这就限制了 PCR技术应用于高通量样本的检测，另外在对PCR产物进行电泳和染色的后处理过程中，需要利用硝酸银或者溴化乙锭染色，容易危害人体健康以及可能对环境造成污染.并且利用硝酸银染色，容易产生较高的背景色，而不利于观察实验结果。
[0006]然而，目前本领域还未见有对菌核病菌特异性检测和诊断试剂的报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是解决现有技术对菌核病菌检测和鉴定主要基于形态学特征、耗时长、灵敏度低、特异性低及经验型强，难以在做到对菌核病害的发生进行及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，提供一种对油菜菌核病菌进行快速检测的试剂和检测方法，特异性强、灵敏度高、准确性强。
[0008]本发明人发现18种不同的植物病原菌在存在3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷下只有油菜菌核病菌的菌丝内特异性地产生一种显著的绿色色素，而其余的供试病原菌菌丝内并没有绿色色素的产生，而菌核病菌在正常条件下生长时其菌丝内并不会产生绿色色素。另外，本发明人还发现在存在亚氨基噻唑烷结构其他衍生物的条件下油菜菌核病菌的菌丝内均特异性地产生显著的绿色色素，所以本发明人利用这一发现完成了本发明。
[0009]本发明首先提供一种检测样品中油菜菌核病菌的方法，包括:(a)将样品接入含有特异性检测试剂的固体培养基或液体培养基中，置于适宜条件下培养，其中所述特异性检测试剂为3-(2-吡啶基)甲基·-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷或其含亚氨基噻唑烷结构的衍生物；和6)目测观察培养所得菌落或镜检观察所得菌丝体的颜色，如观察到绿色菌落或菌丝体，则表明样品中含有油菜菌核病菌。
[0010]在本发明方法的一实施例中，其中所述特异性检测试剂的结构式如下:
[0011]
【权利要求】
1.一种检测样品中油菜菌核病菌的方法，包括: (a)将样品接入含有特异性检测试剂的固体培养基或液体培养基中，置于适宜条件下培养，其中所述特异性检测试剂为3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷或其含亚氨基噻唑烷结构的衍生物；和 (b)目测观察培养所得菌落或镜检观察所得液体培养物中菌丝体的颜色，如观察到绿色菌落或菌丝体，则表明样品中含有油菜菌核病菌。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述特异性检测试剂的结构式如下:
3.如权利要求1或2所述的方法，其中培养基中所述特异性检测试剂的含量为0.1~100.0μ g/mL。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述样品为疑有油菜菌核病菌的农林植物的子叶、茎杆、真叶或者土壤。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中(a)中的培养为，样品接入含有0.1~100.0yg/mL3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷的培养基摇瓶或平板中，置于25°C条件下恒温培养1-3天。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中还包括: Cl)当所述样品为田块土壤时根据固体培养基中出现的绿色菌落数来评估该田块中油菜菌核病菌的潜在危害程度，当所述样品为发病植物组织时根据固体培养基中出现的绿色菌落数来评估该发病植物的发病程度；或者 c2)提取所述油菜菌核病菌菌丝体的绿色色素，并测定其吸光度，其吸光度测定波长在6IOnm至630nm内选取,所述提取方法如权利要求7所述。
7.一种从油菜菌核病菌菌丝体中提取绿色色素的方法，包括以低级醇在酸性条件下浸提菌丝体以提取绿色素。
8.一种用于培养和检测油菜菌核病菌的培养基，包括3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷或其含亚氨基噻唑烷结构的衍生物。
9.3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷或其含亚氨基噻唑烷结构的衍生物在特异性检测油菜菌核病菌中的用途。
10.3-(2-吡啶基)甲基-2-(4-氯苯基)亚氨基噻唑烷或其含亚氨基噻唑烷结构的衍生物在降低油菜菌核病菌致病力中的用途。
【文档编号】C12R1/645GK103571910SQ201310564218
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月14日 优先权日:2013年11月14日
【发明者】黄青春, 丰俊, 李刚月, 钱旭红, 陶黎明, 徐文平 申请人:华东理工大学