专利名称：：一种油菜菌核病的早期快速分子检测方法
技术领域：
：本发明属于植物病害的分子检测检测领域，具体涉及一种油菜菌核病的早期快速分子检测方法。
背景技术：
：由核盘菌[&/"0""/。《;/^油'0'加(1^.)(^8317]引起的油菜菌核病，是我国油菜生产中的首要病害，在长江流域广大油菜种植区尤其严重。一般年份油菜菌核病发病率为10°/。30%，严重时发病率会达到80%，造成油菜产量减少10%70%，含油量降低1%5%，给广大农民造成高达数亿元的经济损失。近年来随着油菜耕作制度的改变，如免耕法的应用，增加了菌核的越冬存活率；"双低"油菜的大面积推广，造成栽培品种的单一，对菌核病的抗性降低，油菜菌核病的发生呈逐年上升的趋势，带来的经济损失也逐年加重。油菜各生育阶段均可感染菌核病，但以花期最为敏感。油菜的花瓣防御机制薄弱，极易被核盘菌的子囊孢子感染。春季气候潮湿，病花瓣迅速腐烂，掉落在植株其他部位引起新的病斑，并迅速扩展形成菌核病的大爆发。这是核盘菌侵染油菜的主要方式。而化学农药难以抵达油菜菌核病的主要侵害部位(如油菜的茎干)，使得病害爆发后的治理效果不理想。但针对油菜菌核病发病的早期，我国目前仍缺乏快速灵敏准确的检测和鉴定技术。传统的微生物学检测鉴定方法需要经过病原物分离、培养和生物学特征分类，费时费力、工作量大，而且比田间病害发展提前不了多少时间，难应用于生产上预测预报。因此，研究油菜菌核病发病早期快速灵敏准确的检测鉴定技术，并应用于菌核病的预测预报中，必将有利亍袖菜菌核病的田间综合管理，促进我国油菜种植业的增产增收。
发明内容本发明的目的旨在提供一种油菜菌核病病发病早期的快速分子检测方法，以实现对油菜菌核病发病早期的快速检测，为油菜菌核病的田间综合管理提供科学、准确的预测预报。本发明的技术方案包括下列步骤1.采集油菜花瓣先将1.5mlEppendorf管灭菌，将待测的随机取样于田间凋谢的油菜花瓣，按一片花瓣装入一个Eppendorf管，将采集的花瓣样本置于-80'C冰箱中冷冻；2.提取油菜花瓣总DNA:将装有油菜花瓣的Eppendorf管从-8(TC冰箱中取出，迅速加入200jil抽提缓冲液，使之浸没过花瓣；用家用微波炉的低火档加热所述的样本，处理时间和顺序依次为20s'20s'15s，以样本不沸腾为宜；从所述微波炉中取出样本后立即再加入200nl抽提缓冲液；80'C水浴5min，中间轻轻摇晃一次；分别加入200nl苯酚和200W氯仿'轻轻混匀；于l2，000rpm离心10min,取上清液，加入800nl-20。C预冷的无水乙醇，轻轻混匀，静置沉淀20min;于12,000rpm离心10min,弃上清，取沉淀置于37。C下干燥约10min;加入15nlddH20，3rC下静置约5min'沉淀溶解'得到油菜花瓣总DNA;3.巢式PCR反应第一次PCR:以ITS4/1TS5为引物进行第一次PCR,扩增反应体系为PCRbuffer,10pmol引物ITS4，lOpmol引物ITS5，0.5UTaqDNA聚合酶，0.2mMdNTP，10^l步骤(2)制备的油菜花瓣总DNA，以ddH20补足25nl，将所述试剂加入后混匀，置于PCR仪内进行扩增；PCR反应参数为95'C4min;94°C30s,50。C45s,72。C30s，30个循环；72。C延伸10min。第二次PCR:以XJJ21/XJJ222为引物的第二次PCR，扩增反应体系为PCRbuffer,10pmol引物XJJ21,10pmol引物XJJ222，0.5UTaqDNA聚合酶，0.2mMdNTP，1h1第—次PCR产物，以ddH20补足25pl;将所述试剂加入后混匀，置于PCR仪内进行扩增，PCR反应参数为95°C4min;94°C30s，63°C30s，72°C30s，30个循环；72。C延伸10min;4.PCR扩增产物分析取4nl第二次PCR扩增产物，加入1^上样缓冲液，混匀，在1.5%(w/v)琼脂糖凝胶中、5V/cm下电泳30min,用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成相系统上成像；5.结果判定将琼脂糖凝胶置于紫外光下，判定是否存在一条大小为292bp的目的条带。其中步骤2所述的抽提缓冲液成分2%十六烷基三乙基溴化铵(w/v)，2%聚乙烯吡咯烷酮(w/v)，1.4M氯化钠，0.1M三羟甲基氨甲烷-盐酸(Tris-HCl，pH8.0)，0.02M乙二胺四乙酸(EDTA);步骤3所述的T叫DNA聚合酶和步骤4所述的上样缓冲液购自宝生物工程(大连)有限公司，即TAKARA公司，下同。步骤3所述的本发明设计的特异引物序列如下ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3';ITS5:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3';XJJ21:5，-GTTGCTTTGGCGTGCTGCTC-3''，XJJ222:5'-CTGACATGGACTCAATACCAATCTG-3';步骤4所述的电泳缓冲液(5XTBE)成分为Tris54g,硼酸27.5g,加入0.5MEDTA(pH8.0)20ml,定溶至1000ml;工作浓度为0.5XTBE。本发明设计了一套核盘菌特异性引物，并成功建立了一种油菜菌核病发病早期的快速检测方法。与其它检测方法相比，本发明具有如下优点1.采用本发明，可以特异性检测出核盘菌。本发明中设计的特异性引物不仅可以区分属于亲缘关系较远的不同属的常见植物叶部病原真菌，如交链孢属的链格孢霉、镰孢属的未谷镰孢菌和盾壳霉属的核盘菌菌核寄生真菌盾壳霉，而且可以区分与核盘菌同属于子囊菌亚门、盘菌纲、柔膜菌目的常见、重要植物叶部病原真菌葡萄孢属的多个种的真菌，参见附图l。而在"Apolymerasechainreaction(PCR)assayforthedetectionofinoculumof&/ero""/"sc/eroft'ora附"FreemanJ，WardE,CarderonC，EuropeanJournalofPlantPathology,2002,108:877-88一文中设计并被其它文章广泛引用的核盘菌特异性引物"SSREV"和"SSFWD"事实上并不能区分核盘菌属和葡萄孢属，如附图2(具体实验步骤参考原文内容)。文献所述的引物对应序列为ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'ITS5:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'SSREV:5'-TGACATGGACTCAATACCAAGCTG-3'SSFWD:5'-GCTGCTCTTCGGGGCCTTGTATGC-3'2.采用本发明，可以检测下限至lfg4tl的核盘菌DNA,其灵敏度高。而传统的微生物学检测方法则不能达到这个灵敏度。3.采用本发明方法检测十分快速，7小时内即可得到准确的检测结果，并可以适时跟踪病害的发生发展情况，并进行及时的预测预报。而传统的微生物学检测则至少需要2天至l个星期以上。图1:是本发明所设计特异性引物对核盘菌及其它真菌分离物总DNA的扩增结果泳道M:100bpDNAmarker,分子量标准从上至下依次为3000bp、2000bp、1500bp、1200bp、1000bp、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp(为Fermentas公司产品，目录号SM0321)。泳道1-22分别为表1所述待检测分离物SUN-F-M、SZ-14、SZ-254、SSSZ-25、SSXG-3、SSXG-25、EP-固Aa、Let-19、Ywd-A、2003-4-1、GariicBc-5、Peonybc-2、Canbc-2、Canbc-6、GarlicBc陽16、GarlicBc-8、GarlicBc-2、LilyBc-2、ZS-1、Chy-l、WH-3和XGGZ-1。泳道23:阴性对照。图2:在"Apolymerasechainreaction(PCR)assayforthedetectionofinoculumof&/erof/"z'asc/eraft'oww"一文中设计的核盘菌特异性引物"SSREV"和"SSFWD"对核盘菌及其它真菌分离物总DNA的扩增结果泳道M:100bpDNAmarker(为Fermentas公司产品)，产品描述如上。泳道1-22分别为表1所述待检测分离物SUN-F-M、SZ-14、SZ-254、SSSZ-25、SSXG-3、SSXG-25、EP-lPNAa、Let-19、Ywd-A、2003-4-1、GarlicBc-5、Peonybc-2、Canbc-2、Canbc-6、GarlicBc-16、GarlicBc-8、GarlicBc-2、LilyBc-2、ZS-l、Chy-l、WH-3和XGGZ-1。泳道23:阴性对照。图3:本发明所设计引物对核盘菌总DNA检测的灵敏度的扩增结果其中，图3-1为核盘菌总基因组DNA浓度为10fg/pl时的扩增结果泳道M:100bpDNAmarker(为Fermentas公司产品)，产品描述如上。泳道1-9分别为9个重复。泳道10为阳性对照；泳道11为阴性对照。图3-2为核盘菌总DNA浓度为1fg/nl时的扩增结果泳道M:100bpDNAmarker(为Fermentas公司产品)，产品描述如上。泳道l-9分别为9个重复。泳道10为阳性对照；泳道11为阴性对照。图4:对油菜田中的凋落花瓣随机抽样检测结果泳道M:100bpDNAmarker(为Fermentas公司产品)，产品描述如上。泳道1-10分别为10个随机样本。泳道11为阳性对照；泳道12为阴性对照。图5:以ITS4/ITS5为引物对核盘菌属菌株SUN-F-M进行PCR扩增得到的片段序列，方框内的碱基为引物。图6:以ITS4/ITS5为引物对葡萄孢属菌株Canbc-2进行PCR扩增得到的全序列，方框内的碱基为引物。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但不是对对本发明的限制。实施例1:检测本发明设计的特异引物对核盘菌及其它真菌分离物的特异性试验1.真菌分离物及真菌菌丝的培养参见表1列举的核盘菌及其它真菌分离物及其采集地点。将真菌分离物接种于PDA培养基(配方及其制作方法用常规方法，即用去皮马铃薯200g，葡萄糖20g和少量蒸馏水煮制，补充蒸馏水至1000ml)上，20。C培养，活化2-3次。再用直径为5mm的打孔器打出含菌丝的琼脂块，接种于铺玻璃纸的PDA平板上，48h后刮取适量菌丝于-20'C冻存。表1待检测分离物采集地点及分子检测结果菌株编号分类名称种名寄主采集地点检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>SSSZ-25核盘齒油菜湖北随州+SSXG-3核盘菌油菜湖北孝感+SSXG-25核盘菌油菜湖北孝感+EP-lPNAa核盘菌多种植物黑龙江佳木斯+Let-19雪腐核盘菌莴苣湖北神农架+Ywd-A三叶草核盘菌豌豆湖北武汉+2003-4-1小核盘菌莴苣湖北神农架GarlicBc-5灰葡萄孢大蒜湖北武汉—Peonybc-2灰葡萄孢牡丹湖北武汉—Canbc-2灰葡萄孢油菜湖北宜昌一Canbc-6灰葡萄孢油菜湖北孝感_GarlicBc-16盲种葡萄孢大蒜湖北竹山—GarlicBc-8葱腐葡萄孢大蒜湖北鄂州—GarlicBc-2葱鳞葡萄孢X跡湖北武汉—■LilyBc-2椭圆葡萄孢百合湖北武汉—ZS-1盾壳霉核盘菌湖北竹山一Chy-1盾壳霉核盘菌湖北长阳—WH-3链格孢霉三叶草湖北武汉—XGGZ-1禾谷镰孢菌小麦湖北孝感—上述待检分离物采用植物病理学常用方法采集和分离;"+"表示可以检测到292bp的目的条带，"一"表示不能检测到292bp的目的条带。2.提取真菌分离物总DNA参考Sambrook等(Sambrook,J.,Frisch,E.F.，Maniatis，T.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,seconded.1989.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY),具体步骤如下称取0.2g于-20'C中冷冻的真菌菌丝在液氮中充分研磨成粉末，转入1ml65'C预热的抽提缓冲液(配方参见前述《
发明内容》中所示)，颠倒混匀；65'C温育5min,中间轻轻混匀两次；加入等体积氯仿/苯酚(v/v=l/l)混匀，12,000rpm离心15min;取上清，再加入等体积氯仿/苯酚(v/v=l/l)再抽提一次；取上清，加入两倍体积的-20'C预冷的无水乙醇，于室温下静置沉淀30min;12,000rpm离心10min，弃上清，再用-20。C预冷的70%乙醇洗两遍，置37'C温箱干燥后，用TE溶解，得到真菌的总DNA，-2(TC保存。3.巢式PCR反应将步骤2中得到的总DNA提取液用ddH2O稀释10倍，用于第一次PCR反应。第一次PCR:以ITS4/ITS5为引物(引物序列参照本说明书《
发明内容》)的第一次扩增反应体系包括PCRbuffer、lOpmol引物ITS4、lOpmol引物ITS5、0.5UTaqDNA聚合酶、0.2mMdNTP、1pl上述的真菌总DNA稀释液，以ddH20补足25pl。将所述试剂加入后混匀，置于PCR仪内进行扩增。PCR反应参数设置为95'C4min;94°C30s、50°C45s、72°C30s，30个循环；72。C延伸10min。将第一次PCR产物用ddH2O稀释10倍，用于第二次PCR。第二次PCR:以XJJ21/XJJ222为引物(引物序列参照本说明书《
发明内容》)的第二次扩增反应体系包括PCRbuffer、lOpmol引物XJJ21、lOpmol引物XJJ222、0.5UTaqDNA聚合酶、0.2mMdNTP、1W第一次PCR产物稀释液，以ddH20补足25pl。将所述试剂加入后混匀，置于PCR仪内进行扩增。PCR反应参数设置为95°C4min;94。C30s、63°C30s、72°C30s，30个循环；72。C延伸10min。4.PCR扩增产物分析取4pl第二次PCR扩增产物，加入lnl上样缓冲液(TAKARA，大连)，混匀，在1.5%(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳，用0.5xTBE作为电泳缓冲液(配方参见前述《
发明内容》中所示)，5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，凝胶成相系统上成像。结果如图l。如果样本为核盘菌，在紫外光下就会出现一条292bp的目的条带；如果不是，则不能扩增到同样分子量的目的条带。实施例2:检测本发明设计的特异引物对核盘菌的灵敏度试验1.核盘菌菌株SUN-F-M菌丝的培养将核盘菌菌株SUN-F-M菌丝接种于PDA培养基(配方参见前述《
发明内容》中所示)上，20'C培养，活化2-3次。再用直径为5mm的打孔器打出含菌丝的琼脂块，接种于铺玻璃纸的PDA(配方如前所述)平板上，24h后刮取适量菌丝于-2(TC冷冻。2.提取核盘菌菌株SUN-F-M的总DNA参考Sambrook等(Sambrook，丄，Frisch,E.F"Maniatis，T.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,seconded.1989.ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY)，具体步骤如下称取0.2g-20'C冷冻的菌丝在液氮中充分研磨成粉末，转入lml65'C预热的抽提缓冲液(配方参见前述《
发明内容》中所示)，颠倒混匀；65。C温育5min，中间轻轻混匀两次；加入等体积氯仿/苯酚(v/v=l/l)混匀，12,000rpm离心15min;取上清，再加入等体积氯仿/苯酚(v/v=1/1)再抽提一次；取上清，加入两倍体积的-20。C预冷的无水乙醇，于室温下静置沉淀30min;12,000rpm离心10min，弃上清，再用-20。C预冷的70%乙醇洗两遍，置37。C温箱干燥后，用TE溶解，得到核盘菌SUN-F-M的总DNA,-2(TC保存。3.紫外分光光度计测量核盘菌菌株SUN-F-M总DNA的浓度(1)取10nl步骤2中所提取的核盘菌菌株SUN-F-M总DNA，用ddH20稀释50倍；(2)用ddH20作为空白，在波长260nm、280nm、310nm处调节紫外分光光度计读数为零；(3)加入DNA稀释液于三处波长处读OD值，并记录；(4)计算DNA浓度，公式如下[dsDNA;h50x(OD26o—ODM。)x稀释倍数(以上浓度单位为|ig/ml)4.核盘菌菌株SUN-F-M总DNA稀释采用x10稀释法，用ddH20将步骤3中己测浓度的核盘菌菌株SUN-F-M总DNA稀释成1000fg^U、100fg/|ul、10fg/nl、lfg/nl、0.1fg/nl，重复三次。5.巢式PCR反应将步骤4中得到的DNA稀释液用于第一次PCR反应。第一次PCR:以ITS4/ITS5为引物(引物序列参照本说明书《
发明内容》)的第一次扩增反应体系包括PCRbuffer、lOpmol引物ITS4、lOpmol引物ITS5、0.5UTaqDNA聚合酶、0.2mMdNTP、10nl上述的核盘菌菌株SUN-F-M总DNA稀释液，以ddH20补足25pl，每个处理设三个重复。将所述试剂加入后混匀，置于PCR仪内进行扩增。PCR反应参数设置为95°C4min;94°C30s、50°C45s、72°C30s,30个循环；72。C延伸10min。第二次PCR:以XJJ21/XJJ222为引物(引物序列参照本说明书《
发明内容》)的第二次扩增反应体系包括PCRbuffer、lOpmol引物XJJ21、10pmol引物XJJ222、0.5UTaqDNA聚合酶、0.2mMdNTP、1|il第一次PCR产物，以ddH20补足25nl。将所述试剂加入后混匀，置于PCR仪内进行扩增。PCR反应参数设置为95°C4min;94°C30s、63°C30s、72°C30s，30个循环；72。C延伸10min。6.二次PCR扩增产物分析取4nl二次PCR扩增产物，加入lnl上样缓冲液(TAKARA，大连)，混匀，在1.5%(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳，用0.5xTBE作为电泳缓冲液(配方参见前述《
发明内容》中所示)，5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，凝胶成相系统上成像。结果如图3-l、3-2。如果核盘菌总DNA样本量充分，在紫外光下就会出现一条292bp的目的条带；如果核盘菌总DNA样本量不充分，则不能扩增到同样分子量的目的条带。统计结果如表2，所设计的引物对核盘菌的检测灵敏度可以达到1fg"l。表2本发明设计的特异引物对核盘菌的灵敏度检测<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>"+"表示可以检测到292bp的目的条带，"一"表示不能检测到292bp的目的条带。实施例3:对大田中的油菜菌核病发病早期实施快速分子检测的具体步骤1.采集油菜花瓣先将1.5mlEppendorf管灭菌。在待检测的位于中国湖北省武汉市华中农业大学油菜田中划分为4x4=16个小区，每个小区采用5点取样法，样本总量为80个。从油菜叶片上收集凋落的花瓣，一片花瓣装入一个Eppendorf管中。-8(TC冰箱中冻存。2.提取油菜花瓣总DNA(1)将装有花瓣的Eppendorf管从-80'C冰箱中取出，迅速加入200抽提缓冲液(配方参见前述《
发明内容》中所示)，使之浸没过花瓣；(2)用家用微波炉的低档火加热，处理时间和顺序依次为20s，20s，15s，以不沸腾为宜，从微波炉中取出后立即再加入200^il抽提缓冲液(配方参见前述《
发明内容》中所示)；(3)8(TC水浴5min,中间轻轻摇晃一次；(4)分别加入200nl苯酚和200^U氯仿，轻轻混匀；(5)12,000rpm离心10min，取上清液，加入800-20。C预冷的无水乙醇，轻轻混匀，静置沉淀20min;(6)12,000rpm离心10min，弃上清，沉淀置丁'37。C下干燥约10min;(7)加入15nlddH20，37。C下静置约5min,沉淀溶解，得到油菜花瓣总DNA。3.巢式PCR反应第一次PCR:以ITS4/ITS5为引物(引物序列参照本说明书《
发明内容》)的第一次扩增反应体系包括PCRbuffer、10pmol引物ITS4、10pmol引物1TS5、0.5UTaqDNA聚合酶、0.2mMdNTP、10nl上述油菜花瓣总DNA，以ddH20补足25^d。将所述试剂加入后混匀，置于PCR仪内进行扩增。PCR反应参数设置为95°C4min;94。C30s、50°C45s、72°C30s，30个循环；72。C延伸10min。第二次PCR:以XJJ21/XJJ222为引物(引物序列参照本说明书《
发明内容》)的第二次扩增反应体系包括PCRbuffer、lOpmol引物XU21、lOpmol引物XJJ222、0.5UTaqDNA聚合酶、0.2mMdNTP、lHl第一次PCR产物，以ddH20补足25pl。将所述试剂加入后混匀，置于PCR仪内进行扩增。PCR反应参数设置为95°C4min;94°C30s、63°C30s、72°C30s，30个循环；72。C延伸10min。4.二次PCR扩增产物分析取4nl二次PCR扩增产物，加入l(il加样缓冲液(TAKALA，大连)，混匀，在1.5%(w/v)琼脂糖凝胶中进行电泳，用0.5xTBE作为电泳缓冲液(配方参见前述《
发明内容》中所示)，5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，凝胶成相系统上成像。如图4。如果油菜花瓣样本上携带核盘菌，在紫外光下就会出现一条292bp的目的条带；如果没有，则不能扩增到同样分子量的目的条带。统计得出，80个样本中PCR阳性出现28次，即阳性出现次数/总样本数=35.0%。本实施例总计只需要7个小时。具体的安排为在步骤2第(5)、(6)步实验间隙可以配制步骤3的第一次PCR反应体系；在步骤3的第一次PCR反应实验间隙可以配制第二次PCR反应的反应体系;在第二次PCR反应实验间隙可以制做步骤4中的琼脂糖凝胶。这样可以充分节省时间。本实施例总计需要时间=lh20min(提取总DNA)+2h30min(第一次PCR)+2h(第二次PCR)+lh(电泳+成像)=7hours序列表aio>华中农业大学<120〉一种油菜菌核病的早期快速分子检测方法〈130〉<141〉2008-12-20〈160〉2<170>Patentlnversion3.1〈210〉1<211〉564<212>咖A<213〉核盘菌(^SWerc^'/7Yasc7er。fj'ariffl)<220><221>gene<222〉(1)..(564)<223><220>〈221〉primer_bind<222〉(545).,(564)<223〉<220><221>primer一bind<222〉(1)..(22)<223〉<400〉1gtcgt肌caaggtttccgtetggtg肌cctgcgg卿gertc60tcatgcccgactcccacccttgtgtattattax:tttgttgctttggcgag120ctgctcttcggggccttgtatgctcgccag3gaac3tcaaaactctttttattaatgtcg180tctgagtacttaaaactttc肌caacggatctcttggttctggcstcgat240gcg犯atgcgtg犯ttgcagaattcagtga300ctttgaacgcacattgcgccccttggtattccggggggcatgcctgttcgagcgtceittt360c肌ccctc朋gctcagc"ggtattgsgtccatgtcagtaatggcaggctct朋^tcag420<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>权利要求1、一种油菜菌核病的早期快速分子检测方法，其特征在于下列步骤(1)采集油菜花瓣先将1.5mlEppendorf管灭菌，将待测的随机取样于田间凋谢的油菜花瓣，按一片花瓣装入一个Eppendorf管，将采集的花瓣样本置于-80℃冰箱中冷冻；(2)提取油菜花瓣总DNA将装有油菜花瓣的Eppendorf管从-80℃冰箱中取出，迅速加入200μl抽提缓冲液，使之浸没过花瓣；用家用微波炉的低火档加热所述的样本，处理时间和顺序依次为20s，20s，15s，以样本不沸腾为宜；从所述微波炉中取出样本后立即再加入200μl抽提缓冲液；80℃水浴5min，中间轻轻摇晃一次；分别加入200μl苯酚和200μ1氯仿，轻轻混匀；于12,000rpm离心10min，取上清液，加入800μl-20℃预冷的无水乙醇，轻轻混匀，静置沉淀20min；于12,000rpm离心10min，弃上清，取沉淀置于37℃下干燥约10min；加入15μlddH2O，37℃下静置约5min，沉淀溶解，得到油菜花瓣总DNA；(3)巢式PCR反应第一次PCR以ITS4/ITS5为引物进行第一次PCR，扩增反应体系为PCRbuffer，10pmol引物ITS4，10pmol引物TTS5，0.5UTaqDNA聚合酶，0.2mMdNTP，10μl步骤(2)制备的油菜花瓣总DNA，以ddH2O补足25μl，将所述试剂加入后混匀，置于PCR仪内进行扩增；PCR反应参数为95℃4min；94℃30s，50℃45s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。第二次PCR以XJJ21/XJJ222为引物的第二次PCR，扩增反应体系为PCRbuffer，10pmol引物XJJ21，10pmol引物XJJ222，0.5UTaqDNA聚合酶，0.2mMdNTP，1μl第一次PCR产物，以ddH20补足25μl；将所述试剂加入后混匀，置于PCR仪内进行扩增，PCR反应参数为95℃4min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min；(4)PCR扩增产物分析取4μl第二次PCR扩增产物，加入1μl上样缓冲液(购自TAKARA公司)，混匀，在1.5％(w/v)琼脂糖凝胶中、5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭(EB)染色15min后，在凝胶成相系统上成像；(5)结果判定将琼脂糖凝胶置于紫外光下，判定是否存在一条大小为292bp的目的条带；其中步骤(2)所述的抽提缓冲液配方为2％十六烷基三乙基溴化铵(w/v)，2％聚乙烯吡咯烷酮(w/v)，1.4M氯化钠，0.1M三羟甲基氨甲烷-盐酸(pH8.0)，0.02M乙二胺四乙酸；步骤(3)所述的本发明设计的特异引物序列如下ITS45’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；TTS5.5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’；XJJ215’-GTTGCTTTGGCGTGCTGCTC-3’；XJJ2225’-CTGACATGGACTCAATACCAATCTG-3’；步骤(4)所述的电泳缓冲液(5×TBE)配方为Tris54g，硼酸27.5g，加入0.5MEDTA(pH8.0)20ml，定溶至1000ml；工作浓度为0.5×TBE。全文摘要本发明属于植物病害分子检测领域，涉及油菜菌核病早期快速分子检测方法。特征包括采集凋谢的油菜花瓣，提取油菜花瓣总DNA，巢式PCR，PCR扩增产物分析，琼脂糖凝胶电泳和结果判定。如样本中存在核盘菌，在紫外光下琼脂糖凝胶中就会出现一条292bp的目的条带；不是则否。本发明的引物不仅可区分亲缘关系较远的不同属的常见植物叶部病原真菌，如交链孢属的链格孢霉、镰孢属的禾谷镰孢菌和盾壳霉属的核盘菌菌核寄生真菌盾壳霉，且可区分与核盘菌同属于子囊菌亚门、盘菌纲、柔膜菌目的常见重要植物叶部病原真菌葡萄孢属的多个种的真菌；其灵敏度高，可检测下限至1fg/μl的核盘菌DNA；本发明快速，7小时内即可得到准确的检测结果，传统微生物学方法至少需2天或1周以上。文档编号C12Q1/04GK101434997SQ200810236958公开日2009年5月20日申请日期2008年12月23日优先权日2008年12月23日发明者付艳苹,姜道宏,黎覃,谢甲涛申请人:华中农业大学