专利名称：一株防治菌核病的生防菌盾壳霉zs-1sb及制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物农药技术领域，具体涉及一株具有菌核病生防潜能的盾壳霉菌株及半敞开式固体发 酵的培养方法与应用。
背景技术：
核盘菌[5Wero""/asc7er"/or咖(Lib.) de Bary]可以侵染64科540多种植物，包括油菜、大豆、 向曰葵等主要的油料作物和莴苣、大白菜、芹菜、胡萝卜等重要的蔬菜作物，在世界范围内引起多种植物 的菌核病。由于迄今为止没有发现对其具有明显抗病性的种植资源，没有抗病品种可以利用，由其引致的 菌核病仍然是农业生产中世界性的难题。目前多采用化学农药进行控制，如于油菜开花盛期喷施化学农药 "菌核净"或"多菌灵"可在一定程度上缓解该病的危害，获得较为理想的效果。由于菌核病多发生、流 行于油菜生长的中后期，需要有特定的农药剂量和劳动强度才能使农药抵达受害部位(油菜的茎部和枝 条)；并且另一个不容忽视的问题是核盘菌的抗药性，长期大面积使用单一性质的农药存在极高的风险。 早在1997年，就有学者发现江苏省通州地区某些田块的抗"多菌灵"菌株出现频率高达100%。同时需要 关注的是食品安全和环境污染问题，食品安全问题往往是国际农产品贸易壁垒中的筹码，要参与国际竞争， 也必需贯彻绿色植保。因此，农药防治应十分慎重，生产上急切需要建立安全持久的防控技术体系。利用 有益真菌防治植物真菌病害是安全持久的防控技术体系的重要组成部分。
盾壳霉(Cb/^o^m'Mz 则V Ws/7S)无性阶段属于腔孢纲，是植物病原真菌核盘菌的重寄生真菌，也 是菌核病的重要生防真菌，可以寄生和破坏核盘菌的菌丝和菌核。盾壳霉首次由美国学者Campbell (1947) 描述和命名，Whi卯s和Gerlagh (1992)对它的生物学特性及防病潜能给予了论述。盾壳霉的分生孢子可 以添加到土壤或喷施于作物地上部分用来控制多种作物的菌核病(Jones et al, 2003; Li et al, 2006)。 申请人:在前期研究中发现盾壳霉一些菌株可以形成分生孢子器，产生大量的分生孢子(Cheng et al, 2003)， 多年的大田试验示范表明具有良好的防病效果，并且盾壳霉对植物没有致病能力，对人畜没有毒害作用。
与其它生防真菌类似，盾壳霉的开发和应用受到规模化生产的限制，目前高效生产盾壳霉的分生孢子 是商业化应用的关键。
发明内容
本发明的目的筛选一株选择对核盘菌(5b/ero"/7ia sc7ero"Vjia)引起的菌核病具有显著生物防治 效果的真菌菌株，并通过简便、易行的半敞开式固体发酵培养方法进行规模化生产，将其开发为多种作物 菌核病的生物防治的微生物菌剂。
本发明自湖北省竹山县蔬菜种植菜园土壤中分离、筛选得到一株对核盘菌菌核具有极强寄生作用的盾 壳霉菌株ZS-1SB，申请人将其命名为盾壳霉(Co/7iot/u^/u/z/;s/77/^"s) ZS-1SB，该菌株已于2009年5月 31日送交用于专利程序的位于湖北省武汉市武汉大学内的国际生物材料样品保藏机构--中国典型培养物 保藏中心(英文简称CCTCC)，其保藏编号为CCTCC N0: M209U4。
实施例的研究表明，本发明筛选的盾壳霉ZS-1SB菌株对植物病原真菌核盘菌和植物病原细菌水稻白 叶枯病菌(Ja""OTO/ as oirzae pv. wyzae)具有较强的拮抗作用，可作为对菌核病具有生防功能的微生 物菌剂。
盾壳霉ZS-1SB的菌学特征
分生孢子黑褐色、椭球形、表面不平，大小为3.5-4.7umX5.3-8.8ym (平均3.9X6.4um),取幼 嫩(白色小点)的分生孢子器压片可见成排排列的基部宽阔的产孢细胞。在PDA平板上，菌丝初期无色，
3气生菌丝不发达，菌丝一边扩展，菌落表面一边形成白色分生孢子器，随培养时间的延长，菌落逐渐变褐， 孢子器吐出黑色水滴即溢出分生孢子。盾壳霉的菌丝在10-28'C范围内均能生长，最适生长温度为20'C， 最高温度为30'C，盾壳霉在pH2-11的环境中均能生长，pH3-4最适宜于其生长。在pH4的PDA平板上菌 落日扩展0.7 cm。
本发明还涉及提供了生产所述的盾壳霉ZS-1SB菌剂的半敞开式固体发酵的规模化培养方法。该方法 采用干燕麦片和米糠为材料，以蒸笼为发酵容器，实现了盾壳霉的规模化生产，其工艺简便易行。 本发明具有下列特点
1、 本发明筛选的盾壳霉菌株ZS-1SB可以明显拮抗水稻白叶枯病菌、寄生核盘菌菌核，具有广泛的潜 在开发价值；
2、 采用上述盾壳霉菌株可以有效的防治油菜菌核病。油菜始花期施用一次(10'°孢子/亩)、始花期施 用一次(10"孢子/亩)，防治效果远远高于多菌灵；
3、 采用上述盾壳霉半敞开式固体发酵的培养方法，培养料配方中，燕麦片和米糠材料廉价、易得，固 体培养料疏松，通透性好，可以使产孢量达到1.5X10"孢子/g干培养料；
4、 采用上述盾壳霉半敞开式固体发酵的培养方法，设备简单，只需蒸笼、火炉和能控温的培养室即可 满足生产的需要，无需其他固体发酵方法所需的高压灭菌设备和固态反应器等专用设备。因此大大降低了 生产成本，适宜于盾壳霉的规模化生产。
5、 采用上述盾壳霉半敞开式固体发酵的培养方法，通过2(TC和16'C变温发酵的措施，可以很好的控 制常见杂菌如根霉菌(ittizo/ws sp.)、曲霉菌Cispei^iL ws sp.)等的污染。
图l:显示本发明筛选的盾壳霉ZS-1SB菌株对水稻白叶枯病菌的拮抗作用。
图2:是本发明实施例的盾壳霉ZS-1SB菌剂半敞开式固体发酵情况。图2A是本发明设计的半敞开式 固体培养方式示意；图2B和图2C是培养终期形成的含有盾壳霉ZS-1SB菌剂的培养物。 图3:是盾壳霉ZS-1SB菌株寄生和致腐核盘菌菌核情况。
具体实施例方式
在下面的实施例中，申请人在室内验证了盾壳霉菌株ZS-1SB对水稻白叶枯病菌的拮抗作用，对该菌 株进行发酵培养、培养物寄生、致腐核盘菌菌核的活性等进行系统验证试验，同时将制备的微生物菌剂进 行油菜菌核病的田间防治试验，以确定其对菌核病的控制作用；
实施例l
1、 盾壳霉ZS-1SB菌株的分离筛选
分离与鉴定从中国湖北省竹山县蔬菜种植园土壤中分离、筛选得到一株对核盘菌菌核具有极强寄
生作用的盾壳霉菌株，申请人将其命名为盾壳霉(Ow/o^K/7'咖肌V 2'te/ s) ZS-1SB，试验表明本发明分 离的ZS-1SB菌株对核盘菌(i: sc化ro"咖)的菌丝生长和水稻主要病原细菌a朋t力OTO朋s wyzae pv. oiTzae)具有较强的拮抗作用，可以作为油菜菌核病的防治的微生物菌剂的候选菌株。
本发明的盾壳霉ZS-lSB分离和筛选采用核盘菌菌核诱捕法(Ad細es等，1980)和稀释平板方法，菌种 鉴定工作参照魏景超，《真菌鉴定手册》上海科学技术出版社，1979版介绍的方法。
2、 菌株保藏本发明的盾壳霉菌株ZS-1SB菌株的保藏，按周德庆主编，《微生物学实验技术手册》， 上海科学技术出版社，1986版介绍的方法操作。
3、 试验和对照菌株的制备
本实施例以本申请人筛选的盾壳霉ZS-1SB菌株为试验菌株，将报道的水稻白叶枯病菌086(成国英等，水稻白叶枯病菌单细胞系毒力分化研究.植物病理学报，2002， 32: 227-234)作为对照。供试的盾壳霉 ZS-1SB的活化条件是20。C PDA培养基(配方马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂10g,补充蒸馏水至1000ml， 调pH至7. 0，在121'C高压蒸汽灭菌30min)平板上活化培养2d。
水稻白叶枯病菌菌株086的活化条件是28'C下将水稻白叶枯病菌086接种至马铃薯固体培养基(配 方马铃薯300g， Ca(N0a)2 4H20 0. 5g, Na臭 12H20 2. 0g,蛋白胨5. 0g,蔗糖15. 0g, 17%的琼脂， 加水至1000ml，调pH至6.8-7.0,在121'C高压蒸汽灭菌30min，下同)划线培养2d,挑取水稻白叶枯病 菌086单菌落，接种至水稻白叶枯病菌液体培养基(配方马铃薯300g，Ca(N03)2 4H20 0. 5g，Na2HP04 12H20 2.0g,蛋白胨5.0g，蔗糖15.0g，加水至1000ml,调pH至6.8-7.0,在121'C高压蒸汽灭菌30min)中， 于28。C, 200r/min振荡培养36h，使测定OD6oo值至2. 0。 4、实验方法
取上述水稻白叶枯病菌086菌液1. 3ml (使0D6。。=2. 0)和水稻白叶枯病菌固体培养基60ml (成分同前) 混匀，迅速倒入直径150 mm的培养皿中，取盾壳霉ZS-1SB菌丝块(直径5mm)置于培养皿中央，于28°C 下培养3d后观察盾壳霉ZS-1SB对水稻白叶枯病菌的拮抗活性。
实验结果表明，表明本发明的盾壳霉ZS-1SB对水稻白叶枯病菌086 (见图l)具有明显的拮抗作用。
实施例2:盾壳霉ZS-1SB菌剂的半敞开式固体发酵培养
1、 盾壳霉ZS-1SB孢子悬浮液制备将盾壳霉ZS-1SB菌株置于PDA培养基(配方参同)斜面上，于 2(TC条件下培养7 d。用无菌水冲洗斜面，调至分生孢子悬浮液为1(f孢子/ml。
2、 盾壳霉ZS-1SB的扩繁培养将步骤l的盾壳霉ZS-1SB的分生孢子悬浮液以质量比为1: 100接种 于PDB培养基(配方马铃薯200g，葡萄糖20g,补充蒸馏水至1000ml，调pH至7.0)，将所述的PDB培 养基分装入三角瓶(每瓶装100ml/250ml)中，在150 r/min， 20。C条件下振荡培养24 h，得到盾壳霉ZS-1 SB菌液，备用。
3、 盾壳霉ZS-1SB菌剂半敞开式固体发酵培养将干培养料(含水量一般不超过8%)燕麦片(商购) 和米糠(商购)以体积比为3: l混匀加入适量水浸涨后，装入内径为49mm、高度为20. 5 irnn的家用蒸笼， 加盖后，旺火常压蒸汽灭菌2 h。冷却后，加入灭菌蒸馏水调节所述的干培养料最终含水量至70%。在培 养室内，将步骤2所述的盾壳霉ZS-1SB菌液以每公斤干培养料添加100 ml的比例接种于培养料，平铺 于蒸笼，使培养料的厚度为5 mm，加盖，置于2CTC培养室培养48 h，然后半敞开蒸笼盖(见图2A)，于 16'C条件下继续培养7 d。经检测本实施例的盾壳霉ZS-1SB菌剂含孢子数可达1. 5X 1(T孢子/g干培养 料(见图2B和图2)。
实施例3:盾壳霉ZS-1SB菌株寄生、致腐核盘菌菌核的活性试验
1、 核盘菌菌核及制备将报道的核盘菌菌株(5Wero"V^a sc/aro"咖)Ep-1PNA367 (Huiquan Liu， Yanping Fu， Daohong Ji肌g， Guoqing Li， Jun Xie, Youliang Peng, Xianhong Yi, and Said A- Ghabrial. A Novel Mycovirus That Is Related to the Human Pathogen Hepatitis E Virus and Rubi-Like Viruses. JOURNAL OF VIROLOGY, Feb. 2009, 1981 - 1991)作为对照，将核盘菌菌株Ep_lPNA367接种于胡萝卜培 养基(将胡萝卜切成条状，12rC灭菌30min)的三角瓶中，20。C培养60 d获得成熟的菌核。
2、 盾壳霉ZS-1SB的制备取实施例2中ZS-1SB的发酵培养终期含菌剂的培养物适量，加自来水后反 复搓洗，洗出盾壳霉的分生孢子液，在3000r/min离心5min,弃上清，以自来水重悬分生孢子沉淀，并 调整至盾壳霉ZS-1SB的分生孢子浓度为107ml。
3、 试验方法取过筛河沙，自来水清洗后，装入三角瓶中于121'C下高压蒸汽下灭菌2h,倒入灭菌的
5培养皿中，加适量无菌水至沙潮湿，然后分别取大小均匀一致的纯培养核盘菌菌核，用70%乙醇消毒后， 无菌水冲洗3次，在盾壳霉ZS-1SB的分生孢子液(107ml)中浸泡30 min,然后将该菌核取出半浸入装 有灭菌细沙的培养皿中，每皿沙盘中放菌核20粒，设5个重复，在20"C下培养。记录盾壳霉ZS-1SB对该 核盘菌菌核的寄生致腐程度。核盘菌菌核腐烂程度分级如下0级，菌核表面无盾壳霉菌丝；1级，菌核 表面有盾壳霉菌丝，但无白色的分生孢子器原基；2级，菌核表面有分生孢子器原基，但表层不腐烂；3 级，菌核表层腐烂、内部变色变软；4级，整个菌核糜烂。
4、试验结果经检测100粒核盘菌菌核均发生腐烂，腐烂程度评定为4级，在腐烂的核盘菌菌核上可 明显见到盾壳霉ZS-1SB的黑色分生孢子器(见图3)。
实施例4:利用盾壳霉ZS-1SB菌剂防治油菜菌核病的田间试验
为了验证本发明生产的盾壳霉ZS-1SB菌剂的防病效果，申请人选择湖北省宜昌市、江西省都昌县和 江西省彭泽县的部分油菜大田进行了油菜菌核病的田间防治试验。
1、 试验药剂
盾壳霉ZS-1SB菌剂取实施例2中发酵终期的含盾壳霉ZS-1SB菌剂的培养物适量，加自来水后反复 搓洗，洗出的分生孢子液，在3000r/min离心5min，弃上清。为了生产上使用方便，将盾壳霉ZS-1SB菌 剂制成孢子沉淀物(107g),每10g为一个包装袋，真空封口保存。
对照药剂为40%多菌灵悬浮剂(购自天津市汉邦植物保护有限责任公司的商品)。
2、 试验设计试验共设3个大区处理，处理不设重复；示范面积共51亩(每亩为666平方米，下同)。 试验设计如下
处理1: 40%多菌灵悬浮剂于油菜初花期施药1次，每亩用40%多菌灵悬浮剂200g兑清水30kg喷雾， 处理面积1亩。
处理2:盾壳霉ZS-1SB菌剂于油菜始花期施药1次，每亩用盾壳霉ZS-1SB菌剂1袋(109孢子/8, 共10g)兑清水30kg喷雾，试验面积为20亩。
处理3:盾壳霉ZS-1SB菌剂于油菜始花期施药1次,油菜初花期再施药1次，每次每亩用盾壳霉ZS-1SB 制剂l袋(10 g)，兑清水30kg喷雾，试验面积为20亩。
对照只喷清水，每亩施用清水30kg，喷雾，试验面积为10亩。
3、 试验地点的条件
(1) 试验地点选湖北省宜昌市夷陵区鸦鹊岭镇白合村，前巷作物为中稻，土质为沙壤土，肥力中等；
(2) 江西省彭泽县芙蓉墩镇五联村，棉油轮作区，田间油菜菌核病常年发生较重，肥力较高，油菜系 冬前育苗移栽，灌溉条件较好；
(3) 江西省都昌县汪墩乡，棉油轮作区，田间油菜菌核病常年发生较重，肥力较高，油菜系冬前育苗 移栽，灌溉条件较好。
4、 试验的油菜品种供试油菜品种为当地主要推广的优质高产(双低型)甘蓝型杂交油菜新品种"华 油杂6号"(该品种由华中农业大学育成，已通过湖北省农作物品种审定委员会审定， 一个公开推广的油 菜新品种)，按照常规方法育苗和移栽。
5、 调査取样方法菌核病病情调査在油菜收获1周前进行，每块田采用棋盘式5点取样方法，每点调 査20株油菜，记载每处理的主茎发病病情指数和相对防效。
病情指数=E [病级数X该级病株数]/ (调査总数X最高病级数)X100
相对防效(％)=(对照菌核病病情指数-处理防菌核病病情指数)/对照菌核病病情指数
6、 结果分析表1本发明盾壳霉ZS-1SB菌剂对油菜菌核病的防治效果
相对防效a)
处 理
_宜昌市彭泽县都昌县
盾壳霉ZS-1SB菌剂施药1次31.4 67.0 79.6 盾壳霉ZS-1SB菌剂施药2次58.3 83.0 85.0 40%多菌灵悬浮剂施药1次 29.0 60.2 74.0 说明两省防治效果出现的差异是各地田间油菜菌核病的自然发生程度的差异 本发明的盾壳霉ZS-1SB菌剂在湖北省和江西省3地各50亩防治试验结果表明，盾壳霉ZS-1SB菌剂 可以有效控制田间油菜菌核病的危害。在油菜始花期施药一次(1(T孢子/亩))，防治效果与化学农药"40% 多菌灵悬浮剂"相当，在油菜始花期施药一次(101(1孢子/亩)、始花期再施药一次(10""孢子/亩)，其防治 效果显著高于40%多菌灵悬浮剂。 上述油菜始花期是指约5_10%的油菜主茎开花；油菜初花期是指油菜始花期后6天。 田间试验结果表明本发明制备盾壳霉ZS-1SB菌剂是一株具有良好的生防价值的真菌菌株(菌剂)，该菌 剂对油菜菌核病或其他作物的菌核病具有较好的防治作用，显示其具有良好的开发应用前景。
主要参考文献
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1、一株油菜菌核病的生防菌盾壳霉(Coniothyrium minitans)ZS-1SB，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM209114。
2、 一株由保藏号为CCTCC NO: M209114的盾壳霉(Com'o/m'"/toraJ ZS-1SB 制备的微生物菌剂。
3、 一种盾壳霉菌剂的制备方法，其特征是，包括采用半敞开式固体发酵培养所述的盾壳 霉菌剂，它还包括如下步骤(1) 盾壳霉ZS-ISB孢子悬浮液的制备将保藏号为CCTCCNO: M209114的盾壳霉ZS-1 SB菌株置于PDA培养基斜面上，于20。C条件下培养7 d;用无菌水冲洗斜面，调整分生孢子 悬浮液至1()6孢子/ml;(2) 盾壳霉ZS-1SB的扩繁培养将步骤(1)的盾壳霉ZS-1SB的分生孢子悬浮液以质量 比为l: 100接种于PDB培养基的三角瓶中，于150r/min， 2(TC条件下振荡培养24 h，得到 盾壳霉ZS-1SB菌液，备用。(3) 盾壳霉半敞开式固体发酵培养将干培养料燕麦片和米糠按体积比为3: 1混匀，加 入适量水浸涨后，装入蒸笼加盖后于旺火常压蒸汽灭菌2 h，冷却后，加入灭菌蒸馏水调节 所述培养料的最终含水量为70%，在培养室内，将步骤(2)所述的盾壳霉ZS-1SB菌液以每 公斤干培养料添加100ral的比例接种于该培养料中，平铺于蒸笼，使所述培养料的厚度为5 mm，加盖，置于20。C培养室培养48 h，然后将蒸笼盖半敞开，于16。C条件下继续培养7 d， 得到所述的盾壳霉菌剂；其中步骤(1)所述的PDA培养基组分及配比为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂10g，补充蒸 馏水至1000ml，调pH至7.0，在12rC高压蒸汽灭菌30min;步骤(2)所述的PDB培养基组分及配比为马铃薯200g，葡萄糖20g，补充蒸馏水至1000ml， 调pH至7.0，在12rC高压蒸汽灭菌30min。
4、 权利要求1所述的盾壳霉(Com'oA;^'"m脂'"/to"^ ZS-1SB在制备防治油菜菌核病微 生物制剂中的应用。
全文摘要
本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一株对核盘菌菌核具有强寄生、致腐活性的盾壳霉菌株的分筛选、鉴定及在微生物菌剂中的应用。所述的盾壳霉(Coniothyrium minitans)ZS-1SB菌株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NOM209114。本发明还公开了所述微生物菌剂的半敞开式固体发酵培养方法及盾壳霉(Coniothyriumminitans)ZS-1SB菌剂在防治油菜菌核病中的应用。本发明的微生物菌剂对油菜菌核病等植物真菌病害具有良好的生防效果。
文档编号C12R1/645GK101603009SQ20091006240
公开日2009年12月16日 申请日期2009年6月5日 优先权日2009年6月5日
发明者付艳苹, 姜道宏, 李国庆, 程家森, 谢甲涛 申请人:华中农业大学