专利名称：油菜iMyAP基因过表达在油菜抗菌核病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用基因工程的手段使黑芥子酶协助蛋 白基因在油菜中过表达，进而显著提高油菜抗菌核病的方法。
背景技术：
菌核病的病原菌为菌盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib) de bary)，它是一种 广谱寄生性真菌，寄主范围广，据Boland和Hall的统计，核盘菌可寄生在75个科的278年 属中的408个种和42亚种或变种。菌盘菌也是一种重要的农作物植物病原菌，在全球，它 每年给农作物生产造成巨大损失，如严重影响油菜、大豆、向日葵、花生、菜豆、红花等几十 种农作物特别是优质农作物的生产。目前，在五大洲近100个国家都有发现或流行。到目 前为止，还没有发现完全抗菌核病的抗性资源，这是被侵害作物生产中面临的巨大挑战。在我国，菌核病是影响油菜特别是优质油菜产量提高的重要病害。为减轻菌核病 对油菜的危害程度，人们试图从不同的植物资源中分离出抗菌核病的有利资源。对油菜抗 菌核病的研究结果表明在核盘菌寄生的不同类型的油菜上，存在对病原菌高抗的类型，但 还没有发现完全抗菌核病的免疫类型资源。由于缺乏抗菌核病免疫类型的资源，通过杂交 育种没法获得对菌核病具免疫类型的材料。正因为如此，利用基因工程的方法培育抗菌核 病油菜，在目前情况下，这是一条必由之路。2002年我们曾经开展用来自小麦的草酸氧化酶 转油菜来增强油菜抗菌核病能力的研究；刘胜毅等报道利用转草酸氧化酶来增强油菜抗菌 核病的研究(Liu et al, Plant Cell Report, 2005, 24 :133-144) 但是效果不是很明显。 这就需要寻求新的抗菌核病的途径。在十字花科芸薹和白菜属植物中，有一种特有的黑芥子酶-硫苷防御系统 (Glucosinolate-Myrosinase system)，现在已知这是一种抵抗植食性昆虫取食的有效防 御系统(Giamoustaris and Mithen，1995)。又名硫代葡糖苷葡糖苷酶(thioglucoside glucosidases, TGG)，其作用是催化硫苷的水解。在植物组织内，黑芥子酶(Myrosinase， EC 3.2.3. 1)需要与黑芥子酶结合蛋白(Myrosinase-bindingprotein，MBP)和黑芥子酶 协助蛋白(Myrosinase-associated proteins, MyAP)共同形成一个黑芥子酶复合物后， 才能将硫苷水解成异硫氰酸酯、腈、恶唑烷硫酮或硫氰酸酯等多种有毒的化合物。这些有 毒化合物能起到阻止昆虫取食的作用。MyAP是一个40kDa的单体糖蛋白，它存在种子特 异与营养器官表达两种类型种子黑芥子酶协助蛋白(ked-MyAP，sMyAP), sMyAP是一种 组成型的蛋白质，它特异地存在于种子中，如种皮细胞；另一种是存在于营养器官中，它是 在受创伤(wounding)的情况下，或者是在脱落酸和甲基茉莉酸诱导下表达的，称为诱导型 MyAP(inducible MyAP, iMyAP) (Taipalensuu, et al,1997,247 :963-971 ；Andreasson, et al,1999,41 (2) :171-80)。我们研究发现，iMyAP不仅受创伤、脱落酸和甲基茉莉酸诱导表达，而且还受 核盘菌诱导表达。将iMyAP的启动子与⑶S(i3_葡萄糖苷酸酶)基因融合的表达框 (iMyAP:: GUS)转到拟南芥中后，带有iMyAP: :GUS的拟南芥喷施核盘菌的毒素草酸后，经
3GUS染色后整个植株为蓝色，说明iMyAP受核盘菌毒素诱导表达，见图1。另外，还发现，在 油菜中有代表性的抗菌核病材料湘油15与感病材料98C40之间，受核盘菌诱导后iMyAP基 因的启动表达时间不同，抗性材料湘油15中的iMyAP基因的表达早于感病材料98C40的 iMyAP基因的表达12小时，见图2。说明iMyAP基因的及时快速表达有利油菜提高对菌核 病病原菌产生抗性。为了有效获得高抗菌核病的油菜，本申请采用基因工程手段，让iMyAP基因成为 过表达的基因。这样在没有核盘菌侵染时，iMyAP就在油菜体内开始表达，使油菜处于防御 系统触发状态(Priming)，对核盘菌的侵染产生快速反应，及时调动自身的防御系统抵抗病 菌侵染，实现大幅度降低核盘菌对油菜生产产生危害的目的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种油菜黑芥子 酶协助蛋白基因(iMyAP基因)过表达在油菜抗菌核病中的应用，是建立一种让原来油菜中 诱导表达的iMyAP基因变成过表达基因，进而使油菜获具有高抗菌核病的能力。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种油菜iMyAP基因在油菜 抗菌核病中的应用，其iMyAP基因序列见SEQ ID NO. 1。含有油菜iMyAP基因的过表达载体在油菜抗菌核病中的应用，其特点是所述过 表达载体是将通过高保真PCR直接从油菜基因组的DNA上克隆的iMyAP基因的完整带内含 子的编码序列，或将通过RT-PCR技术从油菜中扩增出的iMyAP基因的全长CDS插到过表达 启动子的后面得到的过表达载体。一种提高油菜抗菌核病的方法，是将含有油菜iMyAP基因的过表达载体通过农杆 菌介导的转基因技术导入油菜基因组，使iMyAP基因在油菜体内实现过表达，该过表达载 体是将通过高保真PCR直接从油菜基因组的DNA上克隆的iMyAP基因的完整带内含子的编 码序列，或将通过RT-PCR技术从油菜中扩增出的iMyAP基因的全长CDS插到过表达启动子 的后面得到的过表达载体。从而使油菜的防御系统处于一个及时的触发状态(Priming)，一 旦菌核病的病原菌核盘菌孢子落到油菜植株的表面，能立即作出防御反应，实现抗菌核病 的目的。菌核病是广谱真菌性病害，大量的育种实践证明通过传统育种方法无法培育出 对菌核病这种广谱性真菌病害具有完全抗性的油菜品种，因为核盘菌的侵染先于油菜相关 防御系统的有效开启，在核盘菌与油菜这两个对手中，往往是油菜的防御系统先被摧毁，发 病死亡。通过基因工程的方法，有人将草酸氧化酶基因转入到油菜中，试图利用草酸氧化酶 能降解核盘菌侵染油菜后产生的毒素草酸来达到阻止病菌发生，但结果是转草酸氧化酶基 因的油菜对菌核病抗性没有促进作用，因为这种方法实际上还是在核盘菌侵染之后，并且 是在产生毒素草酸之后，错过了防御的有效时期。本方法与其它方法有本质的不同，它是将油菜体内的iMyAP基因诱导表达的形式 改变为过表达的形式，使油菜的防御系统处于一个实时的触发(priming)状态，一旦有核 盘菌接触油菜表面，就能使油菜及时产生防御反应，阻止核盘菌的侵染。
图1是菌核病核盘菌毒素草酸诱导iMyAP:⑶S中⑶S基因的表达(蓝色)。图2是核盘菌诱导后iMyAP基因在抗与感病材料中的不同启动表达时间。图3是带有iMyAP基因完整编码序列的过表达框构建。图4是转基因与非转基因油菜接种核盘菌的发病情况示意图。
具体实施例方式下面结合附图和实例对本发明作进一步描述，但不意味限制本发明的范围。以烟草花叶病毒35S启动子(CaMV35S)与iMyAP基因的全长⑶S融合形成的表达 框，通过转基因技术来提高甘蓝型油菜抗菌核病能力为实施例1.所用材料试剂甘蓝型油菜(Brassica napus)品种为湘油15号；感病品种98C40和其外植体为 子叶柄。菌株和质粒大肠杆菌DH5a、pMD19_T载体、pHB过表达载体购自大连宝生物工程 (大连)有限公司)。农杆菌LBA4404为湖南农业大学生命科学楼植物代谢实验室保存菌 种。酶和化学试剂TaqTMDNA聚合酶购自广州东盛生物科技有限公司。高保真聚合酶 Pfu购自TaKaRa公司。限制性内切酶、DNA T4连接试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。 质粒DNA小量纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自长沙安比奥生物技术有限公司。RT-PCR 1 ^ Fermentas ^ RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit。 pMD19_T 连接试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。琼脂糖西班牙产。酵母提取物、蛋白胨购自 0X0ID.LTD。DNA Marker 购自天根生化科技(北京)有限公司。CTAB,Tris-base,EDTANa2, 卡那霉素、草丁膦及其他生化试剂均购自欧迈生物和国药集团化学试剂有限公司。2.步骤1) iMyAP基因全长⑶S克隆和过表达载体构建iMyAP基因全长CDS克隆引物设计根据网站 NCBI (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/)上 GenBank 公布的 甘蓝型油菜黑芥子酶协助蛋白基因12(iMyAP12)的序列(进入号为Y10156)，采用primer primer5设计引物I^rimerl和I^rimerf，用于扩增iMyAP基因全长CDS，并根据表达载体pHB 的限制性内切酶酶切位点，在上游和下游引物的5'端分别加上BamHI和)(baI酶切位点。 引物由南京金思特生物公司合成。引物序列如下Primerl 5 ‘GGATCCATGGCAACCACCTTCAGTTTAGCGA’ 3，见 SEQ ID NO. 2 ；(斜体为BamHI的识别序列)Primer2 5 ‘TCTAGACTACATAGATTCACTGGCACTGACGACA’ 3，见 SEQ ID NO. 3 ；(斜体为)(bal的识别序列)RT-PCR扩增iMyAP基因全长⑶S 以湘油15号甘蓝型油菜湘油15号叶片为材料， 参照TRIZOL法提取油菜叶片总RNA。根据Fermentas公司的RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit操作步骤，反转录得到cDNA。再以cDNA为模版，采用如下反应体系和 热循环条件扩增iMyAP基因全长⑶S，其序列见SEQ ID NO. 1。
PCR反应体系(30 μ L体系)缓冲液 3 μ L超纯水22. 4 μ L模板2 μ LdNTP0. 8 μ L(10mM 贮液)iMyAP F/R 各 0. 5 μ L (200 μ Μ)Pfu 酶0· 8 μ L热循环程序94°C预变性4分，94°C变性40秒，60°C退火40秒，72°C延伸90秒，循环30次后， 72°C后延伸10分钟，16°C保存。基因扩增仪为Biometra T型。PCR的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖浓度为1. 5%，电压60V，电泳时间 Ihr左右。凝胶分析系统拍照观察。PCR产物回收参照安比奥Gel回收Kit说明进行。PCR产物连接和测序分析由上述高保真Pfu聚合酶扩增得到的PCR产物，先加A尾 后，连接到PMD19-T载体上构建pMD19-iMyAP中间载体。再将pMD19_iMyAP载体转入大肠杆菌 DH5a后，送南京金思特生物公司进行序列测定，其序列见SEQ ID NO. 1。然后将测序结果在 美国国家信息网NCBI上进行同源性比对分析，经GenBank上Blast比对表明，该序列与NCBI 上登录的iMyAP12基因同源性达到了 100%，说明该测序结果与已发表的序列一致。iMyAP基因过表达载体的构建用BamHI和)(bal两个限制性内切酶同时用酶切pHB过表达载体和pMD19_iMyAP 载体。将两种酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，用安比奥的胶回收试剂盒回收两个目标带。 将凝胶中回收的两个目标带(分别为iMyAP基因的全长CDS和线性化的pHB表达载体)混 勻，通过T4连接酶16°C过夜连接。将iMyAP基因的全长⑶S连接到pHB载体上的CaMV35S 启动子后面，构建成pHB-iMyAP过表达载体(见图3)。构建好的ρΗΒ-iMyAP载体通过冻熔 法转入到根癌农杆菌LBA4404中，用于下一步油菜的转化。2)甘蓝型油菜的遗传转化选颗粒饱满，粒形正常，无裂无霉变的感病品种98C40种子灭菌后，将种子均勻播 种于1/5MS培养基上，置于25°C暗室培养4-5天，至子叶展开。从子叶节的上方，用无菌的手 术刀切下带柄的子叶作为转化用外植体。外植体在携带pHB-iMyAP载体的农杆菌LBA4404 溶液中浸染后，将子叶柄平放到MB (未加抗生素)培养基的平板中，暗室中共培养2-3天后 转入到添加有10mg/L草丁膦的MB培养基的平板中筛选培养。每两周更换一次新鲜培养基， 将分化出的幼苗转移到1/2MS培养基上，待到长出发达的根系，打开封口膜一天，再将幼苗 转入到蛭石中练苗1 2周。之后转入盆装土壤中置于室外培养至结实成熟。3)转基因油菜的检测由于iMyAP基因来自油菜基因组本身，转基因植株的检测需要利用pHB_iMyAP载 体上的CaMV35S序列来设计一条正向PCR检测引物I^rimerf，另一条在iMyAP基因全长⑶S 上设计一条反向PCR引物ft~imer4。PCR检测引物序列如下Primer3 5' GGATTGATGTGATAACATGGTGGAG 3‘，见 SEQ ID NO. 4 ；Primer4 5' AACTGATGCATTGAACTTGACGAAC 3‘，见 SEQ ID NO. 5。4)菌核病抗性鉴定
取甘蓝型油菜品种98C40与iMyAP过表达转基因植株各种5株，在生长室20°C左 右生长，待植株长到5片真叶时，用于接种实验。菌核病病原菌核盘菌先在土豆培养基上于
生长大约2-3天，待菌丝生长布满培养基平皿后，用于接种实验。先将菌丝连同培养基 切成1平方厘米左右大小的菌块，然后将菌块反扣在叶片的上表面，每株取四片叶，每片叶 上接种一个菌块。然后将接种的植株移入生长室，并保持相对湿度大于90%。两周后检查 叶面病斑发生情况。3.结果利用农杆菌介导的方法将iMyAP基因的全长⑶S导入到甘蓝型油菜品种98C40的 基因组中，通过筛选，共获得256株抗草丁膦植株。利用ft~imer3/ft~imer4检测引物对进行 的PCR检测，其中6株有PCR扩增产物，并且扩增出的PCR产物分子量大小与预期的分子量 相同，说明已获得转基因植株。转基因植株当代(TO)自交两代后获得T2的转基因纯合子，从T2转基因纯合子中 取5株用于接种试验，每株接种4个菌块；对照98C40做同样的处理。接种两周后对病斑进 行观察，结果显示对照98C40全部20片叶上都有病斑形成，而转基因植株20片叶上没有任 何病斑形成，菌块也干枯(见图4)。说明在油菜中过表达iMyAP基因可以有效提高油菜对 菌核病核盘菌的抵抗能力。
权利要求
1.一种油菜iMyAP基因在油菜抗菌核病中的应用，其iMyAP基因序列见SEQ ID NO. 1。
2.含有油菜iMyAP基因的过表达载体在油菜抗菌核病中的应用，其特征在于所述过 表达载体是将通过高保真PCR直接从油菜基因组的DNA上克隆的iMyAP基因的完整带内含 子的编码序列，或将通过RT-PCR技术从油菜中扩增出的iMyAP基因的全长CDS插到过表达 启动子后面得到的过表达载体。
3.一种提高油菜抗菌核病的方法，是将含有油菜iMyAP基因的过表达载体通过农杆菌 介导的转基因技术导入油菜基因组，使iMyAP基因在油菜体内实现过表达，该过表达载体 是将通过高保真PCR直接从油菜基因组的DNA上克隆的iMyAP基因的完整带内含子的编码 序列，或将通过通过RT-PCR技术从油菜中扩增出的iMyAP基因的全长CDS插到过表达启动 子后面得到的过表达载体。
全文摘要
一种油菜iMyAP基因过表达在油菜抗菌核病中的应用，是将通过高保真PCR直接从油菜基因组的DNA上克隆的iMyAP基因的完整带内含子的编码序列，或将通过RT-PCR技术从油菜中扩增出的iMyAP基因的全长CDS插到过表达启动子的后面得到过表达载体，再导入油菜基因组中得到转基因油菜，使iMyAP基因在转基因植株体内过表达，使油菜处于防御系统触发状态(Priming)，实现油菜对菌核病产生高抗能力，对保护油菜稳产高产具有非常重要意义。
文档编号C12N15/09GK102140446SQ20111002264
公开日2011年8月3日 申请日期2011年1月20日 优先权日2011年1月20日
发明者刘春林, 阮颖 申请人:湖南农业大学