拟南芥AtGDSL基因在油菜抗菌核病及促进种子萌发中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及拟南芥^化asz基因在油菜抗菌核病及促进种子萌发中的应用，属于 植物基因工程和生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 油菜度rassicanapus)是我国第一大油料作物，我国油菜年种植面积700万 公顷（1亿亩)，占全世界的1/3,居世界首位，其所产菜巧油占我国整个食用植物油供应的 40% (沈金雄等，2007)。此外，菜巧油也用于生产生物柴油，是解决全球能源短缺的重要原 料作物。因此油菜不仅是食用油的主要来源，也是重要能源作物，具有十分重要的战略地 位。然而由于我国耕地面积有限，短时期内无法通过增加种植面积提高油菜总产量，我国的 菜巧生产量目前仅能满足国内2/3的消费需求，大量依赖进口。在当前和今后相当长的时 间内，我国都将面临食用油和化石能源短缺的严峻局面。所W提高油菜的抗菌核病和产量 是我们目前急需解决的问题，除了传统育种方法之外，随着生物技术的发展，越来越多的人 们把目光投向通过遗传改良的方法获得性状优良的油菜品种。
[0003] 油菜的生长受到众多环境因素的影响，病原菌W及一些不利的非生物胁迫(包括 干旱、重金属、盐害、低溫、高溫等）都会对其产量造成极大损失，因此，利用基因工程技术， 将一些抗逆相关基因转入到油菜品种中，培育既高产又抗逆的优质新品种是应对食物，能 源资源短缺有效途径之一。为深入发掘并研究油菜抗逆相关基因，提供理论依据和基因资 源。
[0004] 油菜菌核病（Sclerotiniasclerotiorum化ib. )deBary)是限制我国油菜生产 的主要因子之一。在长江中下游及东南沿海油菜主产区，油菜菌核病的发生率很高，产量损 失高达50%W上；全国发生面积在7000万亩W上，产量损失高达30%，严重时达到50-80%。 目前油菜菌核病的防治方法主要是化学防治技术和抗病品种的选育，但化学防治存在防效 不高、病原难W根除、花期喷药困难W及农药残留、环境污染等诸多问题；常规育种因难W 找到有效的抗性材料W及速度非常缓慢等缺点，也很难有效解决抗病问题。由此，对抗菌核 病油菜品种进行分子改良，快速培育抗菌核病品种，是提高菜巧单位面积产量的重要策略。 油菜种子比较小，播种后如果±壤条件和气候条件不合适时，如果种子的萌发不强的话，很 难得到全苗。特别是利用机械化直播时，种子萌发力强，对后期的出苗尤为重要。所W选育 适合全程机械化作业的油菜品种，萌发力强成为一个重要指标。
[0005]GD化脂肪酶家族是一个脂肪酶的重要超家族，植物GD化脂肪酶的功能研究主要 设及到参与生长发育、形态建成、油脂代谢和抗菌核病等生理方面（化等2005;凌华2006; Zhang等 2006;Kim等 2008;Updegraff等 2009;Agee等 2010)。辣椒的仍紅基因在 拟南芥和大肠杆菌中过量表达发现它具有水解酶活性，而且可W抑制假单胞菌和活体寄生 真菌的生长（JeumKyu化ng等2008)。在辣椒受到创伤时，辣椒的另外一个GD化脂肪酶基 因仍紅7可^通过调苄基因仍/资的表达而抵抗损伤（Ki-JeongKim等2008)。拟南芥 紅/W基因可W通过调节水杨酸途径从而抑制黑斑病菌生长；拟南芥紅/化基因能在SA、JA和ET的信号的诱导下表达，并在生长素的负调控下抵抗胡萝h软腐欧文氏菌巧rwinia carotovora)的生长；拟南芥的一种编码GD化-motif的脂肪酶基因化。在盐诱导 下过表达能增强植物的耐盐性，并且该基因在水杨酸调节下可激活对植物病原的抗性 (MiguelAngelNaranjo等 2006)。
[0006] 但对于拟南芥^化asz的作用，目前相关的文献及专利报道甚少。在本研究中我们 发现，将外源^化asz基因导入油菜后所得到的转基因植株植株对菌核病抗性显著增强，种 子的萌发力也加强，运一结果对于增强油菜菌核病抗性及获得适合机械化大规模生产研究 具有重要应用前景。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是针对油菜育种中缺乏株抗病及种子萌发快的基因资 源，提供一种新的抗病及促萌发基因^化asz的用途，为提高油菜抵御菌核病和促进种子萌 发基因工程技术领域提供一种新的有效选择。本发明的目的是提供利用外源拟南芥基因 asz的导入，来培育抗菌核病能力强、萌发快的油菜新材料。
[000引一种外源八做化基因及其同源基因在油菜抗菌核病中的应用，所述八做化基因 的核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示；所述^化asz基因的同源基因核巧酸序列为与SEQID NO. 1至少90%同源的序列或功能相当于SEQIDNO. 1所示序列的亚片段。
[0009] 一种八仿做基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0010] 本发明还提供一种包含所述^化asz基因的重组载体，其特征在于，构建所述重组 载体所选用的载体为可W引导外源基因在植物中表达的载体，本发明还公开了带有^化asz 基因的重组载体PCAMBIA1300 -35S-AtGD化-NOS(载体PCAMBIA1300购于北京鼎国昌盛生 物公司）的构建过程。
[0011] 本发明还提供一种包含所述^化asz基因的转化体，其特征在于，所述转 化体的宿主为植物，所述植物为油菜。本发明还包括含有^化asz基因的重组载体 pCAMBIA1300-35S-AtGD化-N0S转基因细胞系和宿主菌，W及油菜种子。
[0012] 本发明另外还提供一种包含所述^化asz基因在提高油菜抗菌核病及促进种子萌 发中的应用。
[0013] 实现本发明的技术如下： 为了获得本发明的内容，对^化asz基因进行了深入和全面的研究，结果发现该基因的 过量表达显著增强油菜对腐生营养型真菌核盘菌的抗性，此外，^化asz基因的过量表达可 提高油菜种子萌发速率，表明该基因在油菜育种等方面具重要应用前景。
[0014] 根据本发明的一个方面，上述目的可W通过提供植物核盘菌响应及促进种子萌发 基因来实现，所述基因含有SEQIDNO. 1核巧酸序列或与SEQIDNO. 1实质上同源的核巧 酸序列。
[0015] 根据本发明的一个方面，上述目的可W通过提供植物核盘菌响应及促进萌发蛋白 来实现，所述的蛋白含有SEQIDNO. 2核巧酸序列或与SEQIDNO. 2实质上同源的氨基酸 序列。
[0016] 根据本发明的另一个方面，上述目的通过提供含有^化asz基因超表达重组载体 pCAMBIA1300-35S-AtGD化1-NOS(本发明构建，请见实施例1)来实现对油菜植物抗菌核病 控制。
[0017] 根据本发明的另一个方面，上述目的可W通过提供用所述重组载体 pCAMBIA1300-35S-AtGD化-N0S转化的微生物(根癌农杆菌GV3101，购自大连宝生物生物制 品有限公司，W下相同）来实现。
[0018] 根据本发明的另一个方面，上述目的可W通过提供用所述微生物（包含有 pCAMBIA1300-35S-AtGD化-N0S重组载体的根癌农杆菌GV3101转化获得抗性转基因植株。 [001引本发明的优点： 1.本发明中所采用的农杆菌介导的体外浸薩渗透法转化油菜，速度快、成本低、操作简 单。
[0020] 2.本发明构建的pCAMBIA1300-35S-AtGD化-N0S载体转化油菜后所获得的^化aSZ 过量表达株系，为AtGD化的抗病功能研究提供了原材料，也可作为新的抗病育种材料，为 作物抗病育种提供了新的基因源，将有助于培育更优产高质的新品种，有很好的应用前景。
[0021] 3.抗菌核病遗传研究对指导育种实践、品种改良及品种推广均具有重要意义，因 此发掘和鉴定作物抗菌核病基因，并深入探讨抗菌核病基因的分子作用机理，具有重要的 理论意义和应用价值。^化asz转基因油菜植株显著提高菌核病抗性，运对油菜的生产育种 等具有重要指导借鉴意义。
[0022] 4.本发明所构建的八CaSL过表达植株可提高种子萌发速度，运为选育适合全程 机械化播种的油菜提供了新品种。
【附图说明】
[0023] 图1.八仿?化基因与其它物种同源氨基酸序列比对结果。
[0024] 其中各物种的缩写为：Bn(《rassicana/ws):甘蓝型油菜；At( 化siiana):拟南芥；Ca :辣椒；黑色区域显示的为相同的氨基酸，灰色区域显 示的为类似的氨基酸。
[00巧]图2.植物转化重组表达载体1300-35S-AtGD化-N0S构建示意图。
[0026] 图3.植物转化载体1300-35S-AtGD化-N0S的T-DNA插入区结构示意图。
[0027] 图4.油菜八仿做的过表达株系PCR鉴定；图中，1为DNA标准Marker2000; 2阳 性对照；3阴性对照即非转基因野生型NY12 ;4、5、6分别为独立的AtGD化过表达株系#12、 #18、#35。
[0028] 图5.Q-PCR检测过表达株系中^化a化的表达量结果；其中，NY12为非转基因野生 型对照；#12、#18、#35均为独立的^化aSZ过表达转基因株系