一种白秃马勃菌丝体中水溶性活性多糖的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种白秃马勃菌丝体中水溶性多糖的制备方法，其步骤为：将白秃马勃菌接种于固体斜面培养基，恒温培养，得斜面种子；取培养后的斜面接种到一级液体种子培养基中培养；将培养后的一级液体种子接种到二级液体种子中培养；将培养后的二级液体种子接种发酵；将菌丝体与发酵液分离，清水冲净，烘干后研磨得到菌丝体干粉；将菌丝体干粉进行浸提或超声浸提，浓缩液体，加入乙醇沉淀收集白秃马勃菌水溶性活性多糖粗沉淀物，将多糖粗沉淀物用热水溶解，除去游离蛋白质以及小分子杂质，浓缩，加入乙醇沉淀，经干燥得到白秃马勃菌水溶性活性多糖精制提取物。本发明方法易行，制备操作简便，低温、短时、高效。
【专利说明】一种白秃马勃菌丝体中水溶性活性多糖的制备方法
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明属于生物工程与【技术领域】，更具体涉及一种白秃马勃菌丝体中水溶性活性多糖的制备方法。
【背景技术】
[0003]白秃马勃中文别名白马勃，是担子菌纲、灰包目、灰包科、马勃属的药用真菌，是我国著名的药用真菌之一，主要分布于我国河北、山西、辽宁、黑龙江、陕西、甘肃、新疆等地区。子实体小，扁球形，近球形，梨形，浅棕灰色，并有发达的根状的菌丝索。外包被薄，粉状，有斑纹，内包被坚实而脆。孢子体蜜黄色到浅茶色，孢子球形，浅青黄色，直径4~5μπι。光滑或有极细的小疣，常残留有小柄。孢丝同色，稀有的横隔，粗细均匀，4.5~6μπι。幼时可食用，老后药用。白马勃含有赖氨酸、蛋氨酸等人体必需的八种氨基酸以及马勃素、麦角甾醇、类脂、抗败血酸、脱氢抗败血酸和白马勃多糖等，其活性成分具收敛性消炎止血，散热解毒利咽喉，抗肿瘤，提高人体免疫力等功效。由于其优良的食疗保健作用，国际市场对该菌的需求不断增加。马勃多糖主要通过大秃马勃、黄硬皮马勃、褐皮马勃、黄硬皮马勃、梨形马勃等子实体中提取或通过液体深层发酵培养制备胞外多糖。但白马勃的传统生产方法是固体栽培，这种方法周期长、占地面积大，又受季节和原料的限制，使得其子实体活性多糖物质产量低，难以推广，从而使其不能得到充分的利用。从白秃马勃菌丝体中提取水溶性活性多糖目前仍不见文献报道，其它马勃多糖提取则以子实体为材料，经热水浸提，用Sevag法脱蛋白，乙醇沉淀制备多糖，这些方法存在着提取效率低、用时长等问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种白秃马勃菌丝体的培养方法。本发明的目的还在于提供一种白秃马勃菌丝体中水溶性活性多糖的提取方法。
[0005]本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种白秃马勃菌丝体的培养方法，包括如下步骤:
(O将白秃马勃菌接种于PDA固体斜面培养基，于26°C恒温培养5~7天，得到斜面种子。所述的PDA固体斜面培养基包含如下质量百分含量组分:马铃薯18~22%，葡萄糖
1.0~3.0%，酵母粉1.0~2.0%，蛋白胨0.5~0.7%，七水硫酸锌0.01~0.03%,七水硫酸镁0.04~0.07%,磷酸二氢钾0.05~0.15%，琼脂粉1.0~2.0%，余量为水。
[0006](2)取上述斜面种子接种到装有一级液体种子培养基的三角瓶中，加入玻璃珠，于26°C、13 0r/min培养72~96小时。所述的一级液体种子培养基包含如下质量百分含量组分:玉米粉3.0~5.0%，葡萄糖1.0~2.0%，黄豆粉1.0~2.5%，蛋白胨1.5~3.0%，酵母粉1.5~2.5%，七水硫酸镁1.0~2.5%，七水硫酸锌0.1~0.3%，磷酸二氢钾1.5~2.5%，余量为水。[0007](3)将培养72~96小时后的一级液体种子接种到装有二级液体种子培养基的三角瓶中，加入玻璃珠，于26°C、150r/min培养60~72小时。所述的二级液体种子培养基与一级液体种子培养基相同。
[0008](4)将培养60~72小时后的二级液体种子接种到装有发酵培养基A的三角瓶中，于28°C、180r/min培养96小时。所述的发酵培养基A包含如下质量百分含量组分:马铃薯20~30%，蔗糖2.0~4.0%，蛋白胨0.6~1.2%，七水硫酸镁0.2~0.6%，磷酸二氢钾0.3~
0.6%，碳酸钙0.2~0.6%，余量为水。
[0009](5)将菌丝体与发酵液分离，用水冲洗干净，烘干后得到白秃马勃菌丝体。
[0010]步骤(2)优选为取斜面种子3~5环接种到装有IOOmL —级液体种子培养基的250mL三角瓶中，加10~15颗玻璃珠，于26°C、130r/min培养72~96小时。
[0011]步骤(3)优选为将一级液体种子按10% (V/V)的接种量接种到装有IOOmL 二级液体种子培养基的250mL三角瓶中，加10~15颗玻璃珠，于26°C、150r/min培养60~72小时。
[0012]步骤(4)优选为将二级液体种子按6% (V/V)的接种量接种到装有IOOmL发酵培养基A的250mL三角瓶中，于28°C、180r/min培养96小时。
[0013]步骤(4)还可以为:将培养60~72小时后的二级液体种子接种到装有发酵培养基B的IOL发酵罐中，发酵罐装料系数为0.7，罐压为0.04~0.07MPa，于28°C、220r/min培养72小时后放罐。所述的发酵培养基B包含如下质量百分含量组分:玉米粉4.0~6.0%，糖蜜1.0~3.0%，黄豆 粉1.5~3.0%，花生油1.0~2.0%，酵母粉1.5~3.0%，七水硫酸锌
1.0~2.0%，七水硫酸镁1.5~3.0%，磷酸二氢钾2.0~3.0%，余量为水。
[0014]步骤(5)中所述的烘干优选为50°C烘干。
[0015]上述培养基的pH均优选为自然pH。
[0016]一种白秃马勃菌丝体中水溶性活性多糖的提取方法，包括如下步骤:
(I)将通过上述方法得到的白秃马勃菌丝体研磨粉碎，加入去离子水进行浸提或超声，浓缩液体，加入乙醇沉淀收集白秃马勃菌水溶性活性多糖粗沉淀物。
[0017](2)将白秃马勃菌水溶性活性多糖粗沉淀物用热水溶解，再用Sevag法反复除去游离蛋白质，直至检测不到蛋白质，浓缩，再用乙醇沉淀，得到去蛋白质后的白秃马勃菌水溶性活性多糖沉淀物。
[0018](3)将去蛋白质后的白秃马勃菌水溶性活性多糖沉淀物经透析方法分离，除去小分子杂质，得到多糖分子量在3500~8000道尔顿之间的白秃马勃菌水溶性活性多糖精制提取液，加入乙醇沉淀，得到精制沉淀物。
[0019](4)将精制沉淀物干燥得到白秃马勃菌水溶性活性多糖精制提取物。
[0020]步骤(2)中所述的Sevag法具体为=Sevag溶液为三氯乙酸和正丁醇按体积比5:1混合，Sevag溶液和粗多糖溶液按体积比1:2混合，振荡25分钟，静置60分钟，去除蛋白沉淀，反复进行4~6次。
[0021]步骤(2)中所述的干燥优选为加热恒温干燥。
[0022]上述方法中浓缩优选为将提取液浓缩至原体积的1/2~1/4，浓缩采用在50~55 0C > 0.08~0.09MPa下的减压浓缩。
[0023]上述方法中醇析沉淀所用的乙醇优选为体积分数为75%~95%乙醇，用量为浓缩液的2~4倍体积量。
[0024]本发明方法得到的白秃马勃水溶性活性多糖呈白色，易溶于热水，不易溶于正丁醇、丙酮等有机溶剂。
[0025]本发明相对于现有技术具有如下优点和效果:本发明所使用的培养基及发酵工艺是 申请人:经过无数次的试验得出的最佳条件，通过本发明方法培养白秃马勃菌丝，其产量高达11.7g/L，提取得到的白秃马勃水溶性多糖的产量高达153.57mg/L，纯度高达99.86%。
【具体实施方式】
[0026]下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0027]下述实施例中培养基的pH均为自然pH (5~6)。
[0028]实施例1
一种白秃马勃菌丝体中水溶性活性多糖的制备，其步骤是:
(I)将白秃马勃菌接种于PDA固体斜面培养基，于26°C恒温培养6天，得到斜面种子。所述PDA固体斜面培养基中各组分及含量分别为(％):马铃薯20，葡萄糖2.0,酵母粉1.4，蛋白胨0.6，七水硫酸锌0.02，七水硫酸镁0.05，磷酸二氢钾0.10，琼脂粉1.0，余量为水。
[0029](2)取上述斜面种子3~5环，接种到装有IOOmL —级液体种子培养基的250mL三角瓶中，加12颗玻璃珠，于26°C、130r/min培养96小时。所述的一级液体种子培养基中各组分及其含量分别为(％):玉米粉4.0,葡萄糖2.0，黄豆粉1.0，蛋白胨2.0，酵母粉2.0，七水硫酸镁1.5，七水硫酸锌0.1，磷酸二氢钾2.0，余量为水。
[0030](3)将培养96小时后的一级液体种子按10% (V/V)的接种量接种到装有IOOmL 二级液体种子培养基的250mL三角瓶中，加12颗玻璃珠，于26°C、150r/min培养60小时。所述的二级液体种子培养基与一级液体种子培养基相同。
[0031](4)将培养60小时后的二级液体种子按6% (V/V)的接种量接种到装有IOOmL发酵培养基A的250mL三角瓶中发酵，于28°C、180r/min培养96小时。所述的发酵培养基A各组分及含量分别为(％):马铃薯20，蔗糖2.0，蛋白胨0.6，七水硫酸镁0.2，磷酸二氢钾
0.3，碳酸钙0.2，余量为水。
[0032](5)将菌丝体与发酵液分离，用纯净水冲洗干净，于50°C烘干后研磨得到1.166g菌丝体干粉。
[0033](6)将上述白秃马勃菌丝体干粉加入到其40倍质量的去离子水中，在50或51或52或53°C浸提3小时，重复3次，合并3次提取液，将提取液在6000rpm下离心5min。滤液在52°C减压(0.08~0.09MPa)浓缩至原体积的1/3，搅拌下向浓缩提取液中加入3倍体积95% (V/V)乙醇，将浓缩提取液中的多糖沉淀析出，收集得11.43mg白秃马勃菌丝体多糖粗沉淀物。
[0034](7)向多糖粗沉淀物中加入热去离子水溶解，使之充分复溶，用Sevag法去除蛋白，重复进行，直到检测不出蛋白质；减压浓缩(条件同(6))后，加入3倍体积95% (V/V)乙醇沉淀，沉淀接着用乙醇洗涤，得到去蛋白质后的白秃马勃菌丝体多糖沉淀物10.74mg。
[0035](8)将去蛋白质后的多糖沉淀溶于热水，用去离子水透析，得到分子量3500~8000道尔顿之间的白秃马勃多糖精制液，在搅拌下再加入3倍体积95% (V/V)乙醇沉淀，静置析出精制沉淀物10.2Img0[0036](9)将精制沉淀物50°C恒温干燥得到白秃马勃精制多糖固体10.12mg，该多糖颜色为白色，纯度为99.54%ο
[0037](10)本发明白秃马勃多糖测定采用苯酚-硫酸法，测定方法如下:
精确称葡萄糖0.1Og (预先在105°C烘干至恒重)于小烧杯中，用少量去离子水溶解后定量转移到100mL容量瓶中，以去离子水定容至刻度线，摇匀，其浓度为1.0mg/mL，分吸取OmL、0.02mL,0.04mL、0.06mL,0.08mL,0.lOmL.0.12 mL 于比色管中，补加蒸馏水至 2.0mL，接着加入5%苯酚溶液1.0mL，摇匀后立即滴加5.0mL浓硫酸(物质的量浓度为18.4mol ,L-1),混合均匀后25°C保温20min，测定各溶液在490nm处的吸光度值，绘制标准曲线。取白秃马勃多糖样品，按照标准液配制的方法配制样品液，测定吸光度，从标准曲线计算多糖含量。
[0038]实施例2
一种白秃马勃菌丝体中水溶性活性多糖的制备，其步骤是:
(O白秃马勃菌丝体干粉的制备同实施例1步骤(1)~(5)。
[0039](2)将上述白秃马勃菌丝体干粉加入到其40倍质量的去离子水中，在50或51或52或53°C超声6min，重复3次，合并3次提取液，将提取液在6000rpm下离心5min。滤液在52°C减压(0.08~0.09MPa)浓缩至原体积的1/3，搅拌下向浓缩提取液中加入3倍体积95% (V/V)乙醇，将浓缩提取液中的多糖沉淀析出，收集得13.99mg白秃马勃菌丝体多糖粗沉淀物。
[0040](3)向多糖粗沉淀物中加入热去离子水溶解，使之充分复溶，用Sevag法去除蛋白，重复进行，直到检测不出蛋白质。减压浓缩(条件同(2))后，加入3倍体积95% (V/V)乙醇沉淀，沉淀接着用乙醇洗涤，得到去蛋白质后的白秃马勃菌丝体多糖沉淀物13.57mg。
[0041](4)将去蛋白质后的多糖沉淀溶于热水，用去离子水透析，得到分子量3500~8000道尔顿之间的白秃马勃多糖精制液，在搅拌下再加入3倍体积95% (V/V)乙醇沉淀，静置析出精制沉淀物13.43mg。
[0042](5)将精制沉淀物50°C恒温干燥得到白秃马勃精制多糖固体13.36mg,该多糖颜色为白色，纯度为99.81%。
[0043]实施例3
一种白秃马勃菌丝体中水溶性活性多糖的制备，其步骤是:
(I) 二级液体种子的制备同实施例1步骤(1)~(3)，不同的是(3)中一级液体种子接种后培养的时间是72小时。
[0044](2)将培养72小时后的二级液体种子按6% (V/V)的接种量接种到装有发酵培养基B的IOL发酵罐中，发酵罐装料系数为0.7，罐压为0.04或0.05或0.06或0.07MPa,于28°C、220r/min培养72小时后放罐。所述的发酵培养基B各组分及含量分别为(％):玉米粉5.0，糖蜜1.5，黄豆粉2.0，花生油1.0，酵母粉2.0，七水硫酸锌1.0，七水硫酸镁1.5，磷酸二氢钾2.0,余量为水。
[0045](3)将菌丝体与发酵液分离，清水冲净，于50°C烘干后研磨得到80.64g菌丝体干粉。
[0046](4)将上述白秃马勃菌丝体干粉加入40倍质量的去离子水，在50或51或52或53°C浸提 3小时，重复3次，合并3次提取液，将提取液在6000rpm下离心5min。滤液在52°C减压(0.08~0.09MPa)浓缩至原体积的1/3，搅拌下向浓缩提取液中加入3倍体积95%(V/V)乙醇，将浓缩提取液中的多糖沉淀析出，收集得0.887g白秃马勃菌丝体多糖粗沉淀物。
[0047](5)向多糖粗沉淀物中加入热去离子水溶解,使之充分复溶,用Sevag法去除蛋白，重复进行，直到检测不出蛋白质。减压浓缩(条件同(4))后，加入3倍体积95% (V/V)乙醇沉淀，沉淀接着用乙醇洗涤，得到去蛋白质后的白秃马勃菌丝体多糖沉淀物0.834g。
[0048](6)将去蛋白质后的多糖沉淀溶于热水，用去离子水透析，得到分子量3500~8000道尔顿之间的白秃马勃多糖精制液，在搅拌下再加入3倍体积95% (V/V)乙醇沉淀，静置析出精制沉淀物0.809g。
[0049](7)将精制沉淀物50°C恒温干燥得到白秃马勃精制多糖固体0.802g,该多糖颜色为白色，纯度为99.62%。
[0050]实施例4
一种白秃马勃菌丝体中水溶性活性多糖的制备，其步骤是:
(I)二级液体种子的制备同实施例1步骤(1)~(3)，不同的是(3)中一级液体种子接种后培养的时间是72小时。
[0051](2)将培养72小时后的二级液体种子按6% (V/V)的接种量接种到装有发酵培养基B的IOL发酵罐中，发酵罐装料系数为0.7，罐压为0.04或0.05或0.06或0.07MPa,于28°C、220r/min培养72小时后放罐。所述的发酵培养基B各组分及含量分别为(％):玉米粉5.0，糖蜜1.5，黄豆粉2.0，花生油1.0，酵母粉2.0，七水硫酸锌1.0，七水硫酸镁1.5，磷酸二氢钾2.0,余量为水 。
[0052](3)将菌丝体与发酵液分离，清水冲净，于50°C烘干后研磨得到80.36g菌丝体干粉。
[0053](4)将上述白秃马勃菌丝体干粉加入到其40倍质量的去离子水中，在50或51或52或53°C超声6min，重复3次，合并3次提取液，将提取液在6000rpm下离心5min。滤液在52°C减压(0.08~0.09MPa)浓缩至原体积的1/3，搅拌下向浓缩提取液中加入3倍体积95% (V/V)乙醇，将浓缩提取液中的多糖沉淀析出，收集得1.125g白秃马勃菌丝体多糖粗沉淀物。
[0054](5)向多糖粗沉淀物中加入热去离子水溶解，使之充分复溶，用Sevag法去除蛋白，重复进行，直到检测不出蛋白质。减压浓缩(条件同(4))后，加入3倍体积95% (V/V)乙醇沉淀，沉淀接着用乙醇洗涤，得到去蛋白质后的白秃马勃菌丝体多糖沉淀物1.091g。
[0055](6)将去蛋白质后的多糖沉淀溶于热水，用去离子水透析，得到分子量3500~8000道尔顿之间的白秃马勃多糖精制液，在搅拌下再加入3倍体积95% (V/V)乙醇沉淀，静置析出精制沉淀物1.080g。
[0056](7)将精制沉淀物50°C恒温干燥得到白秃马勃精制多糖固体1.075g,该多糖颜色为白色，纯度为99.86%ο
[0057]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种白秃马勃菌丝体的培养方法，其特征在于包括如下步骤: (O将白秃马勃菌接种于PDA固体斜面培养基，于26°C恒温培养5~7天，得到斜面种子；所述的PDA固体斜面培养基包含如下质量百分含量组分:马铃薯18~22%，葡萄糖1.0~3.0%，酵母粉1.0~2.0%，蛋白胨0.5~0.7%，七水硫酸锌0.01~0.03%,七水硫酸镁0.04~0.07%,磷酸二氢钾0.05~0.15%，琼脂粉1.0~2.0%，余量为水； (2)取上述斜面种子接种到装有一级液体种子培养基的三角瓶中，加入玻璃珠，于26°C、130r/min培养72~96小时；所述的一级液体种子培养基包含如下质量百分含量组分:玉米粉3.0~5.0%，葡萄糖1.0~2.0%，黄豆粉1.0~2.5%，蛋白胨1.5~3.0%，酵母粉1.5~2.5%，七水硫酸镁1.0~2.5%，七水硫酸锌0.1~0.3%，磷酸二氢钾1.5~2.5%，余量为水； (3)将培养72~96小时后的一级液体种子接种到装有二级液体种子培养基的三角瓶中，加入玻璃珠，于26°C、150r/min培养60~72小时；所述的二级液体种子培养基与一级液体种子培养基相同； (4)将培养60~72小时后的二级液体种子接种到装有发酵培养基A的三角瓶中，于28°C、180r/min培养96小时；所述的发酵培养基A包含如下质量百分含量组分:马铃薯20~30%，蔗糖2.0~4.0%，蛋白胨0.6~1.2%，七水硫酸镁0.2~0.6%，磷酸二氢钾0.3~0.6%，碳酸钙0.2~0 .6%，余量为水； (5)将菌丝体与发酵液分离，用水冲洗干净，烘干后得到白秃马勃菌丝体。
2.根据权利要求1所述的白秃马勃菌丝体的培养方法，其特征在于:步骤(2)为取斜面种子3~5环接种到装有IOOmL —级液体种子培养基的250mL三角瓶中，加10~15颗玻璃珠，于26°C、130r/min培养72~96小时。
3.根据权利要求1所述的白秃马勃菌丝体的培养方法，其特征在于:步骤(3)为将一级液体种子按10%的接种量接种到装有IOOmL 二级液体种子培养基的250mL三角瓶中，加10~15颗玻璃珠，于26°C、150r/min培养60~72小时。
4.根据权利要求1所述的白秃马勃菌丝体的培养方法，其特征在于:步骤(4)为将二级液体种子按6%的接种量接种到装有IOOmL发酵培养基A的250mL三角瓶中，于28°C、180r/min培养96小时。
5.根据权利要求1所述的白秃马勃菌丝体的培养方法，其特征在于:步骤(4)为将培养60~72小时后的二级液体种子接种到装有发酵培养基B的IOL发酵罐中，发酵罐装料系数为0.7，罐压为0.04~0.07MPa,于28°C、220r/min培养72小时后放罐；所述的发酵培养基B包含如下质量百分含量组分:玉米粉4.0~6.0%，糖蜜1.0~3.0%，黄豆粉1.5~3.0%，花生油1.0~2.0%，酵母粉1.5~3.0%，七水硫酸锌1.0~2.0%，七水硫酸镁1.5~3.0%，磷酸二氢钾2.0~3.0%,余量为水。
6.根据权利要求1所述的白秃马勃菌丝体的培养方法，其特征在于:步骤(5)中所述的烘干为50°C烘干。
7.一种白秃马勃菌丝体中水溶性活性多糖的提取方法，其特征在于:包括如下步骤: (I)将通过权利要求1~6任一项所述的方法得到的白秃马勃菌丝体研磨粉碎，加入去离子水进行浸提或超声，浓缩液体，加入乙醇沉淀收集白秃马勃菌水溶性活性多糖粗沉淀物；(2)将白秃马勃菌水溶性活性多糖粗沉淀物用热水溶解，再用Sevag法反复除去游离蛋白质，直至检测不到蛋白质，浓缩，再用乙醇沉淀，得到去蛋白质后的白秃马勃菌水溶性活性多糖沉淀物； (3)将去蛋白质后的白秃马勃菌水溶性活性多糖沉淀物经透析方法分离，除去小分子杂质，得到多糖分子量在3500~8000道尔顿之间的白秃马勃菌水溶性活性多糖精制提取液，加入乙醇沉淀，得到精制沉淀物； (4)将精制沉淀物干燥得到白秃马勃菌水溶性活性多糖精制提取物。
8.根据权利要求7所述的白秃马勃菌丝体中水溶性活性多糖的提取方法，其特征在于:步骤(2)中所述的干燥为加热恒温干燥。
9.根据权利要求7所述的白秃马勃菌丝体中水溶性活性多糖的提取方法，其特征在于:所述的方法中浓缩为将提取液浓缩至原体积的1/2~1/4，浓缩采用在50~55°C、0.08~0.09MPa下的减压浓缩。
10.根据权利要求7所述的白秃马勃菌丝体中水溶性活性多糖的提取方法，其特征在于: 所述的方法中醇析沉淀所用的乙醇为体积分数为75%~95%乙醇，用量为浓缩液的2~4倍体积量。
【文档编号】C12P19/04GK103993051SQ201410241551
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年6月3日 优先权日:2014年6月3日
【发明者】张华山, 阳飞, 王伟平, 苏正定 申请人:湖北工业大学