一种具有降血糖功能的甜玉米芯多糖组分的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有降血糖功能的甜玉米芯多糖组分的制备方法，属于天然药物的领域。本发明的目的在于提供一种具有降血糖作用的甜玉米芯多糖组分的制备方法。本发明方法如下：一、将甜玉米芯粉碎，过筛，加入正己烷，室温下搅拌处理，离心后取沉淀在室温下晾干得到甜玉米芯粉；二、然后加入pH＝6的缓冲溶液、纤维素酶和果胶酶，微波提取，再恒温下水浴加热，离心处理后取上层清液；三、脱蛋白后脱色；四、用80％乙醇醇沉静置，加入蒸馏水充分溶解后，通过DEAE?52进行分离，梯度洗脱，收集洗脱液，取蒸馏水洗脱后的组分过SephadexG?75柱层析纯化。本发明方法的甜玉米芯多糖组分得率较高，降血糖效果明显，制备方法简单。
【专利说明】
一种具有降血糖功能的甜玉米芯多糖组分的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于天然药物技术领域;具体涉及一种具有降血糖功能的甜玉米芯多糖组 分的制备方法。
【背景技术】
[0002] 全球有两大著名玉米黄金带，分别位于美国和中国。在我国传统农产品加工中，大 部分甜玉米副产物甜玉米芯，作为清除饲料或都被埋于地下，造成极大的资源浪费。甜玉米 芯可用于制备饴糖、木糖醇、葡萄糖、糖醛、活性炭、酿酒、碎料板、粘结剂等。天然活性多糖 成分是近年来的研究热点。多糖类化合物通常没有细胞毒性，不影响正常细胞功能，具有高 效低毒的特点，是开发降血糖和免疫调节药物、功能性食品的重要来源具有广阔的前景。其 中以植物多糖的水溶性多糖最为重要。大量实验证明，许多植物多糖能够清除自由基、提高 抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化等活性，起到保护生物膜和延缓衰老的作用。研究发现，许 多多糖能减少脂质过氧化产物丙二醛的生成量，增加 S0D、GSH-px活性，降血糖等，在中药药 理中发挥着重要作用。
[0003] 糖尿病是一种以慢性高血糖为特征的代谢紊乱性疾病。在我国II型糖尿病占所有 糖尿病的90%以上。从天然药物尤其是植物中寻求降血糖的有效成分是一条重要的途径。 在国内，植物多糖近年来得到了广泛的研究。表明多糖可降低糖尿病小鼠的血糖水平。研究 表明安吉白茶多糖、茶花多糖、芜菁多糖在缓解糖尿病小鼠糖耐量降低方面具有显著的作 用，并且达到了药物组的治疗水平。目前报道玉米须多糖、黄酮、皂苷类化合物经药效学实 验证明均具有降低糖尿病小鼠血糖的作用，黄酮组降血糖的作用效果更显著。研究表明玉 米须水提物对正常小鼠有轻微的降血糖功能，还可阻止胆固醇在肝脏合成，因此具有降低 血液中胆固醇和甘油三酯的作用。但对玉米芯及甜玉米芯降血糖的研究未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种具有降血糖作用的甜玉米芯多糖组分的制备方法，甜 玉米芯多糖组分得率较高，降血糖效果明显，制备方法简单，具备一定的经济和社会效益。
[0005] 本发明中的一种具有降血糖功能的甜玉米芯多糖组分的制备方法是由下述步骤 完成的：
[0006] 步骤一、将甜玉米芯粉碎，过筛，加入正己烷，室温下搅拌处理，离心后取沉淀在室 温下晾干得到甜玉米芯粉；
[0007] 步骤二、向步骤一制得的甜玉米芯粉加入pH = 6的缓冲溶液、纤维素酶和果胶酶， 微波提取，再恒温下水浴加热，离心处理后取上层清液；
[0008] 步骤三、然后依次进行脱蛋白和脱色处理；
[0009] 步骤四、用80 % (体积）乙醇醇沉静置过夜，加入5mL蒸馏水充分溶解后，通过DEAE-52进行分离，依次用蒸馏水、浓度为0. lmol/L的NaCl溶液、浓度为0.2mol/L的NaCl溶液及浓 度为0.3mo 1/L的NaCl溶液梯度洗脱，采用苯酚硫酸法隔管跟踪监测，收集洗脱液，取蒸馏水 洗脱后的组分过S印hadexG-75柱层析纯化，得到具有降血糖功能的甜玉米芯多糖组分。
[0010] 进一步限定，步骤一中过80目筛。
[0011]步骤一中甜玉米芯的质量与正己烷的体积之比为lg: 10mL。
[0012] 步骤一中室温下搅拌时间为30min。
[0013] 步骤二中pH = 6的缓冲溶液是pH为6的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，甜玉米 芯粉的质量与pH=6的缓冲溶液的体积之比为lg:20mL。
[0014] 步骤二中纤维素酶和果胶酶的总质量占甜玉米芯粉质量的1%，纤维素酶和果胶 酶的质量比为3:2。
[0015] 步骤二中微波功率为600W，微波时间8min。
[0016] 步骤二中95 °C恒温水浴2~2 · 5h。
[0017] 步骤三中脱蛋白：吸取50mL的上层清液，加入木瓜蛋白酶酶，木瓜蛋白酶酶添加量 为1.8%(酶的质量为甜玉米芯质量的2%)，调节pH至7.2,52°C水浴条件下酶1.7h后，进行 沸水浴5min。冷却后，3000r/min离心10min。上清液以体积比3:1加入Sevag试剂混合，常温 下搅拌lh，静置2h分层，除去有机试剂层和蛋白层。
[0018] 步骤三中脱色:加入D301R树脂，在43°C振荡2h，反复脱色直至色素完全脱除。
[0019]本发明方法得到的甜玉米芯多糖组分均一，为白色粉末，与茚三酮反应呈阴性，说 明样品中不含氨基酸或者蛋白质，碘-碘化钾实验呈阴性，说明其中不含有淀粉。Molish反 应呈阳性，在样品试液和硫酸的交界面有一圈紫色环，说明甜玉米芯多糖样品中含有糖类、 多糖或甙类，斐林实验证明甜玉米芯多糖组分不含有还原糖，而水解后反应生成砖红色沉 淀。
[0020] 本发明具有降血糖作用对改善糖尿病大鼠的体重减轻和高血糖症状及脏器损伤 有显著效果，制备方法简单，具备显著的经济和社会效益。
【附图说明】
[0021] 图1是甜玉米芯多糖分级结果图；图2是SCP-80级分DEAE-52洗脱曲线；图3是SCP-80级分SephadexG-200洗脱曲线。
【具体实施方式】
【具体实施方式】 [0022] 一:本实施方式中甜玉米芯多糖降血糖活性组分制备，按以下步骤 操作：
[0023] 步骤一、原料甜玉米芯经粉碎机粉碎，过80目筛子，向过筛甜玉米芯中以lg: 10mL 的比加入正己烧，室温下搅拌30min，4000r/min离心10min，沉淀在室温下瞭干，即得脱脂甜 玉米芯粉。
[0024] 步骤二、准确称取10g脱脂甜玉米芯粉，按1:20的料液比（g:mL)加入pH = 6的缓冲 溶液磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，天津基准化学试剂有限公司）、纤维素酶和果胶酶 (纤维素酶和果胶酶质量比为3:2,复合酶总质量占甜玉米芯粉质量的1%)，搅拌均匀后置 于微波合成仪中，在25°C、600w的条件下处理8min(利用微波处理提高细胞内部温度使细胞 外部压力增大直至使细胞壁破裂，从而加速细胞内部的有效成份的释放从而被溶解）。 [0025] 然后置于50°C恒温水浴锅内浸提2.5h，酶解后的样品灭酶后冷却到室温，4000r/ min离心处理lOmin。
[0026] 弃残渣，取上清液备用，用苯酚-硫酸法检测多糖含量，测得多糖含量为16.7 %。
[0027] 步骤三、将步骤二提取的上清液采用seveg-酶法脱蛋白，木瓜蛋白酶添加量为 1.8 % (酶的质量为甜玉米芯质量的2 % )，调节pH至7.2，52°C水浴条件下酶解1.7h后，进行 沸水浴5min。冷却后，3000r/min离心10min后上清液以体积比3:1加入Sevag试剂混合，常温 下搅拌lh，静置2h分层。除去有机试剂层和蛋白层。
[0028]将脱蛋白后的粗多糖按液料比为15:1添加 D301R树脂，在43 °C振荡2h，反复2次(色 素完全脱除）。
[0029] 步骤四、然后分别以乙醇体积浓度10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80% 和90 %进行醇沉静置过夜。
[0030] 取SCP-80 1 · Og，加入5mL蒸馏水充分溶解后，通过DEAE-52 (2 · 6 X 60cm)进行分离， 取蒸馏水洗脱后的组分过SephadexG-75柱层析(2.6X 100cm)进一步纯化，采用苯酸硫酸法 隔管跟踪监测，最终得到甜玉米芯多糖均一组分SCP-80-I (白色粉末）。
[0031] 由图1可知，用80%乙醇沉淀获得的甜玉米芯多糖组分得率较高。
[0032]由图2可知，采用DEAE-52分离SCP-80得三个组分，其中蒸馏水洗脱得SCP-80-I回 收率最高。
[0033] 由图3可知，采用SephadexG-75纯化，证明SCP-80-I为均一组分。
[0034]采用下述试验验证SCP-80-I降血糖药效，具体内容如下：
[0035] A ·实验动物
[0036]雄性Wista大鼠，体质量170_175g，购自长春亿斯实验动物有限责任公司，生产许 可证号:N〇.SCXk(Ji)-2011-0004。各组动物均在同样环境下饮水、摄食，保持自然光照。动 物饲料由长春亿斯实验动物中心提供。
[0037] B.实验材料
[0038]链脲佐菌素 STZ(购于Sigma公司）；盐酸二甲双胍片（贵州圣济堂制药有限公司）； 罗氏血糖测定仪和血糖试纸(德国罗氏公司）；全自动生化分析仪（日本日立一 7060型） [0039] C.实验方法
[0040] (1)糖尿病动物模型的建立
[00411将80只雄性Wista大鼠饲养一周后，抽取10只作为正常对照组，普通饲料喂养，其 余70只用于造模。高脂饲料配方:基础饲料78.8%，蛋黄粉10%，猪油10%，胆盐0.2%，胆固 醇1%。正常对照组喂食基础饲料，其他各组则喂食高脂饲料。大鼠自由饮水及摄食，21天后 禁食过夜（12h)，次日采血。确定高脂模型建立。
[0042] (2)实验分组与药物剂量
[0043] 70只高脂模型大鼠给腹腔内注射STZ溶液(55-60mg/kg，柠檬酸缓冲溶液，pH4.2- 4.5)，禁食16h，尾静脉采血，用血糖测定仪测定空腹血糖浓度（FBGhlOnmol/L彡FBG彡 25nmol/L为造模成功，确定为糖尿病模型。符合标准的糖尿病模型小鼠60只，随机分为5组， 每组12只。具体分组和灌胃剂量如下：第1组为正常大鼠+相同剂量的生理盐水灌胃，第2组 为糖尿病模型大鼠+相同剂量的蒸馏水灌胃，第3组为糖尿病模型大鼠+低剂量SCP-80-I灌 胃100mg/(kg · d)，第4组为糖尿病模型大鼠+中剂量SCP-80-I灌胃200mg/(kg · d)，第5组为 糖尿病模型大鼠+高剂量SCP-80-I灌胃400mg/(kg · d)，第6组为糖尿病模型大鼠+盐酸二甲 双胍灌胃400mg/(kg · d)。灌胃前将各药品溶解后配成溶液，按一定比例连续灌胃21d。
[0044] (3)体质量和血糖含量测定
[0045] 大鼠糖尿病模型建立后，分别在灌胃0、7、14、21d每组禁食不禁水12h后，测定小鼠 体质量并剪采血，采用罗氏血糖仪测定血糖的含量
[0046] (4)指标测定
[0047] 大鼠连续灌胃21d后，禁食12h，乙醚麻醉，由其腹主动脉采血处死，取血6-8mL，室 温凝固约60min，3000r/min离心10min，分离血清，-20 °C冰箱保存，待测。用全自动生化分析 仪测定血清中总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白 胆固醇(HDL-C)的含量。大鼠处死后，立即解剖摘取大鼠肝脏、肾脏和胰腺并称重。计算各脏 器指数[程素娇，乌饭树树叶降血糖研究[D].江南大学硕士论文，2013]。
[0048] (5)统计学分析
[0049] 采用DPS 9.50软件进行数据处理和方差分析，试验结果以"i±/'表示，组间差异 比较采用t检验，以p〈0.05为有统计学显著差异性。
[0050] D.结果
[0051 ] (1) SCP-80-I对糖尿病大鼠体质量影响
[0052]由表1可知，在实验初期，各组体重之间并无显著差异。一周之后，对照组的体重增 长高于其他组，阳性对照组和药物治疗组体重也呈增长趋势。一周后，模型组与对照组比 较，体重显著下降（P〈〇. 01)。中剂量组合低剂量组与模型组比较，体重没有显著差异（P> 0.05)。阳性对照组和高剂量组与模型组对比，体重变化有差异(p〈0.05)。3周后，模型组体 重显著低于各药物组(P〈〇.〇l)。阳性对照组和SCP-80-I各组与对照组相比有显著差异，呈 剂量依赖性。
[0053] 表1SCP-80-I对STZ诱导大鼠体质量的影响
[0054]
[0055] 注:&:卩〈0.05，厶:？〈0.01与正常组比；13:?〈0.05,8:?〈0.01与对照组比 ；(3:?〈0.05;
[0056] C:P〈(h01与阳性对照组比
[0057] (2) SCP-80-I对糖尿病大鼠血糖影响
[0058]由表2可知，小鼠腹腔注射STZ后，血糖显著升高，均大于10mm〇l/L说明糖尿病小鼠 模型造模成功，给药前，模型对照组与各药物组比较无显著差异(P>〇.05)。连续给药7d后， 阳性对照组和SCP-80-I各组与对照组相比均可降低大鼠血糖(？〈0.01，？〈0.05)。给药21(1 后，阳性对照组和SCP-80-I各组都可显著降低大鼠血糖水平(p〈0.01)，并呈剂量依赖性。说 明SCP-80-I具有良好的降血糖作用。
[0059] 表2SCP-80-I对STZ诱导大鼠血糖的影响
[0060]
[0061] 注:&:?〈0.05，厶:？〈0.01与正常组比；13:?〈0.05,8:?〈0.01与对照组比 ；
[0062] c: P〈0 · 05，C: P〈0 · 01 与阳性对照组比
[0063] (3) SCP-80-I对糖尿病大鼠脏器系数影响
[0064]由表3可知，SCP-80-I各组与模型组相比，脏器指数有显著升高(p〈0 · 05，p〈0 · 01)。 这表明，高脂肪和糖尿病大鼠出现明显的肝脏肿胀现象，肾脏和胰腺肥大。实验结果表明， SCP-80-I可以改善这些现象并呈剂量依赖性。
[0065] 表3SCP-80-I对STZ诱导大鼠脏器系数的影响
[0066]
[0067]
[0068] 注:a: P〈0 · 05，A: P〈0 · 01 与正常组比；b: P〈0 · 05，B: P〈0 · 01 与对照组比；
[0069 ] c: P〈〇 · 05，C: Ρ〈0 · 01 与阳性对照组比
[0070] (4)SCP-80_I对糖尿病大鼠血糖影响
[0071] 从表3可知，在灌胃21d后，SCP-80-I高剂量和中剂量组与对照组相比可显著降低 TC、TG、和LDL-C水平，升高HDL-C水平。SCP-80-I低剂量可降低TC和LDL-C。SCP-80-I各组呈 一定的量效关系，其中高剂量的效果最为显著。说明SCP-80-I可以改善STZ诱导糖尿病大鼠 的血脂水平。
[0072] 表4SCP-80-I对STZ诱导大鼠血脂的影响
[0073]
[0074] 注:a: P〈0 · 05，A: P〈0 · 01 与正常组比；b: P〈0 · 05，B: P〈0 · 01 与对照组比。
[0075]经过动物试验证明，本实施方式方法得到的SCP-80-I具有显著的降血糖效果。
【主权项】
1. 一种具有降血糖功能的甜玉米芯多糖组分的制备方法，其特征在于该方法是由下述 步骤完成的： 步骤一、将甜玉米芯粉碎，过筛，加入正己烷，室温下搅拌处理，离心后取沉淀在室温下 瞭干得到甜玉米芯粉； 步骤二、向步骤一制得的甜玉米芯粉加入pH=6的缓冲溶液、纤维素酶和果胶酶，微波 提取，再恒温下水浴加热，离心处理后取上层清液； 步骤三、然后依次进行脱蛋白和脱色处理； 步骤四、用80 % (体积）乙醇醇沉静置过夜，加入5mL蒸馏水充分溶解后，通过DEAE-52进 行分离，依次用蒸馏水、浓度为〇. lmo 1/L的NaCl溶液、浓度为0.2mo 1/L的NaCl溶液及浓度为 0.3mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，采用苯酚硫酸法隔管跟踪监测，收集洗脱液，取蒸馏水洗脱 后的组分过S印hadexG-75柱层析纯化，得到具有降血糖功能的甜玉米芯多糖组分。2. 根据权利要求1所述一种具有降血糖功能的甜玉米芯多糖组分的制备方法，其特征 在于步骤一中过80目筛。3. 根据权利要求1所述一种具有降血糖功能的甜玉米芯多糖组分的制备方法，其特征 在于步骤一中甜玉米芯的质量与正己烷的体积之比为lg: 10mL。4. 根据权利要求1所述一种具有降血糖功能的甜玉米芯多糖组分的制备方法，其特征 在于步骤一中室温下搅拌时间为30min。5. 根据权利要求1所述一种具有降血糖功能的甜玉米芯多糖组分的制备方法，其特征 在于步骤二中pH = 6的缓冲溶液是pH为6的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，甜玉米芯粉 的质量与pH=6的缓冲溶液的体积之比为1 g: 20mL。6. 根据权利要求1所述一种具有降血糖功能的甜玉米芯多糖组分的制备方法，其特征 在于步骤二中纤维素酶和果胶酶的总质量占甜玉米芯粉质量的1%，纤维素酶和果胶酶的 质量比为3:2。7. 根据权利要求1所述一种具有降血糖功能的甜玉米芯多糖组分的制备方法，其特征 在于步骤二中微波功率为600W，微波时间8min。8. 根据权利要求1所述一种具有降血糖功能的甜玉米芯多糖组分的制备方法，其特征 在于步骤二中95 °C恒温水浴2~2.5h。9. 根据权利要求1所述一种具有降血糖功能的甜玉米芯多糖组分的制备方法，其特征 在于步骤三中脱蛋白：吸取50mL的上层清液，加入木瓜蛋白酶酶，添加量为1.8%，调节pH至 7.2,52 <€水浴条件下酶1.711后，进行沸水浴5111；[11，冷却后，300〇1'/111；[11离心1〇111；[11。上清液以 体积比3:1加入Sevag试剂混合，常温下搅拌lh，静置2h分层，除去有机试剂层和蛋白层。10. 根据权利要求1所述一种具有降血糖功能的甜玉米芯多糖组分的制备方法，其特征 在于步骤三中脱色:加入D301R树脂，在43°C振荡2h，反复脱色直至色素完全脱除。
【文档编号】A61P3/10GK106084082SQ201610487000
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】马永强, 迟淳良, 王鑫, 周恪驰, 庄星光
【申请人】哈尔滨商业大学