硬皮马勃菌根苗的合成方法
【专利摘要】本发明涉及菌类人工栽培领域，具体而言，涉及一种硬皮马勃菌根苗的合成方法。该硬皮马勃菌根苗的合成方法，包括下列步骤：1)将含有硬皮马勃子实体的组织置于母种培养基中培养，得到硬皮马勃母种，将硬皮马勃母种接种到液体菌种培养基中，培养得到硬皮马勃液体菌种；和/或，将硬皮马勃孢子粉配制成硬皮马勃孢子悬浮液；2)培养宿主树的无菌苗；3)待无菌苗长出侧根时，在其根系接种硬皮马勃液体菌种或硬皮马勃孢子悬浮液，保持基质湿润，维持温度为25℃±3℃，培养得到硬皮马勃菌根苗。本发明提供的合成方法可以有效建立硬皮马勃菌种与宿主树的共生关系，能够成功合成硬皮马勃菌根苗，菌根感染率高达85％-90％。
【专利说明】硬皮马勃菌根苗的合成方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及菌类人工栽培领域，具体而言，涉及一种硬皮马勃菌根苗的合成方法。
【背景技术】
[0002] 硬皮马勃是一种食、药用真菌，最早载于《名医别录》，味辛性平，入肺经，有消肿、 止血、解毒等功效，用于咽喉肿痛及各种出血。现代医学研究表明，硬皮马勃具有多种药 理作用和临床应用，含有甾体化合物、萜类化合物、小分子含氮化合物、马勃多糖、蛋白质、 肽类等化学成分有抑菌、抗炎、止咳、杀虫、抗肿瘤细胞的作用，具有很高的药用价值。崔磊 2006年报道，从马勃的新鲜子实体中分离出新蛋白质，其对小鼠脾细胞显示一种抗促细胞 分裂剂活性，能减少乳腺癌细胞的生存能力。从硬皮马勃中分离得一种类似泛激素的肽，此 肽对乳腺癌细胞有较强的抗增殖活性。
[0003] 硬皮马勃含有丰富的蛋白质、矿物质、微量元素及氨基酸，幼嫩子实体肉质细腻， 美味可口而深受广大消费者的喜爱，是老百姓餐桌上喜闻乐见的美味佳肴，又因其公认的 药用价值而成为一种重要的食、药用菌倍受消费者青睐。但硬皮马勃自然产量有限且随大 大量的人为采摘，资源越来越少。人工栽培是增加资源、保护生态环境，维持可持续发展的 重要方向。而菌根苗合成是硬皮马勃人工栽培的首要问题，菌根苗人工合成就是建立硬皮 马勃与其宿主树的共生关系，是实现硬皮马勃人工栽培的第一步。但目前很难人工合成菌 根苗，或者是人工合成时菌根感染率很低。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种硬皮马勃菌根苗的合成方法，以解决上述的问题。
[0005] 本发明提供的硬皮马勃菌根苗的合成方法，包括下列步骤：
[0006] (1)将含有硬皮马勃子实体的组织置于母种培养基中培养，得到硬皮马勃母种，将 硬皮马勃母种接种到液体菌种培养基中，培养得到硬皮马勃液体菌种；
[0007] 和 / 或，
[0008] 将硬皮马勃孢子粉配制成硬皮马勃孢子悬浮液；
[0009] (2)将思茅松、云南松或高山松的种子培养至萌发出白色芽点移栽入无菌苗培养 基中培养得到无菌苗；
[0010] (3)待无菌苗长出侧根时，在其根系接种硬皮马勃液体菌种或硬皮马勃孢子悬浮 液，保持基质湿润，维持温度为25°C ±3°C，培养得到硬皮马勃菌根苗。
[0011]本发明提供了两种硬皮马勃菌种与无菌苗接种合成菌根苗，分别为：硬皮马勃孢 子悬浮液和硬皮马勃液体菌种。这样不仅丰富了硬皮马勃菌种的来源，而且硬皮马勃孢子 悬浮液的制备和培养要比硬皮马勃液体菌种简单，并且菌根感染率相差无几。
[0012] 本发明选择思茅松、云南松或高山松为宿主树种，通过单独培养硬皮马勃菌种和 单独培养宿主树的无菌苗，并通过选择在无菌苗长出侧根时接入硬皮马勃菌种，保持基质 湿润，维持温度为25°C ±3°C，培养得到了硬皮马勃菌根苗。
[0013] 优选地，所述液体菌种培养基包括下列组分，按重量份计：
[0014] 马钤薯100-200份，葡萄糖10-20份，酒石酸铵1-2份，蛋白胨2-4份，MgS041-2份， ΚΗ 2Ρ041-2份，水500-1500份；优选地，马钤薯120-180份，葡萄糖12-18份，酒石酸铵1-2 份，蛋白胨 2-4 份，MgS04l-2 份，ΚΗ2Ρ041-2 份，水 800-1200 份；
[0015] 所述母种培养基为在所述液体菌种培养基各组分及用量的基础上增加15-20份 的琼脂。
[0016] 优选地，所述无菌苗培养基包括下列组分，按重量份计：
[0017] 蛭石 15000-40000 份，珍珠岩 20000-50000 份，草炭 50000-100000 份，红壤 土 100000-300000 份，腐殖质 10000-30000 份，磷酸二氢铵 100-200 份，MgS04100-200 份，ΚΗ2Ρ04100-200份；优选地，蛭石20000-30000份，珍珠岩30000-40000份，草炭 60000-90000 份，红壤土 150000-250000 份，腐殖质 15000-25000 份，磷酸二氢铵 120-180 份，MgS04130-180份，KH2P04120-180份；优选地，腐殖质包括牛粪。
[0018] 优选地，在步骤（1)中，配制硬皮马勃孢子悬浮液的方法为：按重量份计，向 50-500份硬皮马勃孢子粉中加入500-5000份无菌水，得到硬皮马勃孢子悬浮液。
[0019] 优选地，在步骤（3)中，每株无菌苗接种硬皮马勃孢子悬浮液5-10ml，所述硬皮马 勃孢子悬浮液的菌球浓度为5 X 106-5 X 101°个/ml。
[0020] 优选地，在步骤（1)中，将含有硬皮马勃子实体的组织置于母种培养基中后，在 27°C ±2°C的温度下，暗光培养得到硬皮马勃母种。
[0021] 优选地，在步骤（1)中，将硬皮马勃母种接入液体菌种培养基中后保持基质湿润， 维持温度为27°C ±2°C，在125-160r/min的转速下振荡暗光培养振荡暗光培养8-12天。
[0022] 优选地，在步骤（3)中，每株无菌苗接种硬皮马勃液体菌种10_20ml，所述硬皮马 勃液体菌种的菌球浓度为1000-2000个/ml。
[0023] 优选地，所述母种培养基和所述液体菌种培养基的pH分别为4. 0-6. 0。
[0024] 优选地，在步骤（1)中，在向液体菌种培养基中接种硬皮马勃母种之前，对液体菌 种培养基进行灭菌处理。
[0025] 本发明通过选择合适的母种培养基和液体菌种培养基的各种组分及其用量，使 得母种培养基适于将硬皮马勃子实体组织培养为硬皮马勃母种，液体菌种培养基适于将 硬皮马勃母种培养为硬皮马勃液体菌种，培养所得硬皮马勃液体菌种的菌球浓度高达 1000-2000 个 /ml。
[0026] 在配制硬皮马勃孢子悬浮液的过程中，发明人通过控制硬皮马勃孢子粉与水的用 量比例，使得配制出的硬皮马勃孢子悬浮液的菌球浓度为5X 106-5X 101°个/ml。
[0027] 无菌水是将水中微生物杀死或过滤而得到的水，水中的无机盐等不会减少。发明 人在配制硬皮马勃孢子悬浮液时选择无菌水的目的是防止水中带入的杂菌对培养的影响。
[0028] 实验中发现摇床的转速对菌类的生长也有一定影响。当转速低于125r/min时，菌 丝生长量明显减少，菌丝分散程度明显降低；而当转速高于160r/min时，虽然菌丝分散程 度高，但菌丝太短，菌丝团较小，不利于后续的接种，从而降低了菌根感染率。因此，本发明 将摇床转速控制在125-160r/min。
[0029] 本发明中控制每株无菌苗接种硬皮马勃孢子悬浮液5-10ml或硬皮马勃液体菌种 10-20ml，使得接种量既能满足接种需要，又不至于接种量太大造成浪费，从而可以为后续 接种提供菌种，减少培养硬皮马勃菌种的次数。
[0030] 发明人在实验中发现，当所述母种培养基和所述液体菌种培养基的pH分别为 4. 0-6. 0时，菌种生长速度较快，而当pH小于4. 0或pH大于6. 0时，菌种的生长均受到抑 制，所以在培养过程中要及时调整母种培养基和液体菌种培养基的pH为4. 0-6. 0。
[0031] 为了进一步消除杂菌对培养液体菌种的影响，在向液体菌种培养基中接种硬皮马 勃母种之前，对液体菌种培养基进行灭菌处理。
[0032] 本发明所提供的合成方法可以有效建立硬皮马勃菌种与宿主树的共生关系，能够 成功合成硬皮马勃菌根苗，菌根感染率高达85% -90%。
【具体实施方式】
[0033] 实施例1
[0034] (1)按下列比例称取配制母种培养基的各种组分：马钤薯100g，葡萄糖10g，酒石 酸铵lg，蛋白胨2g，MgS0 4lg，KH2P04lg，琼脂15g，水500ml ;将各组分混合，调节pH至4.0， 得到母种培养基，将母体培养基置于25mmX 200mm的试管中；
[0035] (2)采集野生中等成熟的硬皮马勃子实体，在超净工作台中无菌操作，用解剖刀切 取子实体中间部分2mmX 5mmX 10mm的组织块，将该组织块放入盛有母种培养基的试管中， 将试管置于27°C ±2°C的环境中，暗光培养，待菌丝体长满试管斜面，得到硬皮马勃母种；
[0036] (3)按下列比例称取配制液体菌种培养基的各种组分：马钤薯100g，葡萄糖10g， 酒石酸铵lg，蛋白胨2g，MgS0 4lg，KH2P04lg，水500ml ;将各组分混合，调节pH至4. 0,得到 液体菌种培养基，取300ml液体菌种培养基于500ml的三角瓶中，在121°C的温度下灭菌 30min，冷却待用；
[0037] (4)向三角瓶中加入硬皮马勃母种，加入量为1试管硬皮马勃母种加入10个三角 瓶中，将三角瓶置于27°C ±2°C的环境中，在125r/min下振荡暗光培养12天，得到液体菌 种，菌球浓度为2000个/ml ;
[0038] (5)在组培瓶底部平铺一层滤纸，用自来水浸湿，然后用包头纸系好，121°C灭菌 30min，冷却待用；
[0039] (6)精选思茅松成熟种子，用自来水冲洗2h，之后用30% H202浸泡15min，同时不 断摇动，然后用无菌水冲洗三次。放入灭菌的组培瓶中，每瓶放入5粒种子，置于23°C ±3°C 的环境中黑暗处培养，每天检查2次，剔除污染杂菌的种子，至种子萌发出白色芽点；
[0040] (7)按下列比例称取配制无菌苗培养基的各种组分：蛭石15kg，珍珠岩20kg，草炭 50kg，红壤土 100kg，牛粪 10kg，磷酸二氢铵 100g，MgS04100g，KH2P04100g ;将蛭石、珍珠岩、 草炭预湿，加入红壤土、牛粪，将磷酸二氢铵、MgS04、KH2P0 4加150ml水溶解，喷洒入基质中， 混匀，121°C灭菌50min，冷却后将基质装入用高锰酸钾消毒的塑料盆中；
[0041] (8)将萌发的种子移栽入塑料盆中，置于温室大棚中，保持基质湿润，在 25 °C ±3 °C的温度下培养无菌苗；
[0042] (9)待无菌苗长出侧根时，在其根系接种10ml液体菌种，保持基质湿润，在温度为 25 °C ±3 °C的环境中培养3个月。
[0043] 实施例2
[0044] (1)按下列比例称取配制母种培养基的各种组分：马钤薯200g，葡萄糖20g，酒石 酸铵2g，蛋白胨4g，MgS042g，KH2P042g，琼脂20g，水1500ml ;将各组分混合，调节pH至6· 0， 得到母种培养基，将母体培养基置于25mmX 200mm的试管中；
[0045] (2)采集野生中等成熟的硬皮马勃子实体，在超净工作台中无菌操作，用解剖刀切 取子实体中间部分2mmX 5mmX 10mm的组织块，将该组织块放入盛有母种培养基的试管中， 将试管置于27°C ±2°C的环境中，暗光培养，待菌丝体长满试管斜面，得到硬皮马勃母种；
[0046] (3)按下列比例称取配制液体菌种培养基的各种组分：马钤薯200g，葡萄糖20g， 酒石酸铵2g，蛋白胨4g，MgS0 44g，KH2P042g，水1500ml ;将各组分混合，调节pH至6. 0,得到 液体菌种培养基，取300ml液体菌种培养基于500ml的三角瓶中，在121°C的温度下灭菌 30min，冷却待用；
[0047] (4)向三角瓶中加入硬皮马勃母种，加入量为1试管硬皮马勃母种加入10个三角 瓶中，将三角瓶置于27°C ±2°C的环境中，在160r/min下振荡暗光培养8天，得到液体菌 种，菌球浓度为1000个/ml ;
[0048] (5)在组培瓶底部平铺一层滤纸，用自来水浸湿，然后用包头纸系好，121°C灭菌 30min，冷却待用；
[0049] (6)精选高山松成熟种子，用自来水冲洗lh，之后用30% H202浸泡30min，同时不 断摇动，然后用无菌水冲洗三次。放入灭菌的组培瓶中，每瓶放入5粒种子，置于23°C ±3°C 的环境中黑暗处培养，每天检查2次，剔除污染杂菌的种子，至种子萌发出白色芽点；
[0050] (7)按下列比例称取配制无菌苗培养基的各种组分：蛭石40kg，珍珠岩50kg，草炭 100kg，红壤土 300kg，牛粪 30kg，磷酸二氢铵 200g，MgS04200g，KH2P04200g ;将蛭石、珍珠岩、 草炭预湿，加入红壤土、牛粪，将磷酸二氢铵、MgS04、KH2P0 4加150ml水溶解，喷洒入基质中， 混匀，121 °C灭菌50min，冷却后将基质装入用高锰酸钾消毒的塑料盆中；
[0051] (8)将萌发的种子移栽入塑料盆中，置于温室大棚中，保持基质湿润，在 25 °C ±3 °C的温度下培养无菌苗；
[0052] (9)待无菌苗长出侧根时，在其根系接种20ml液体菌种，保持基质湿润，在温度为 25 °C ±3 °C的环境中培养3个月。
[0053] 实施例2的菌根感染率为85. 37 %。
[0054] 实施例3
[0055] (1)按下列比例称取配制母种培养基的各种组分：马钤薯140g，葡萄糖14g，酒石 酸铵lg，蛋白胨2g，MgS0 4lg，KH2P04lg，琼脂15g，水800ml ;将各组分混合，调节pH至4. 5， 得到母种培养基，将母体培养基置于25mmX 200mm的试管中；
[0056] (2)采集野生中等成熟的硬皮马勃子实体，在超净工作台中无菌操作，用解剖刀切 取子实体中间部分2mmX 5mmX 10mm的组织块，将该组织块放入盛有母种培养基的试管中， 将试管置于27°C ±2°C的环境中，暗光培养，待菌丝体长满试管斜面，得到硬皮马勃母种；
[0057] (3)按下列比例称取配制液体菌种培养基的各种组分：马钤薯140g，葡萄糖14g， 酒石酸铵lg，蛋白胨2g，MgS0 4lg，KH2P04lg，水800ml ;将各组分混合，调节pH至4. 5,得到 液体菌种培养基，取300ml液体菌种培养基于500ml的三角瓶中，在121°C的温度下灭菌 30min，冷却待用；
[0058] (4)向三角瓶中加入硬皮马勃母种，加入量为1试管硬皮马勃母种加入10个三角 瓶中，将三角瓶置于27°C ±2°C的环境中，在135r/min下振荡暗光培养11天，得到液体菌 种，菌球浓度为1800个/ml ;
[0059] (5)在组培瓶底部平铺一层滤纸，用自来水浸湿，然后用包头纸系好，121°C灭菌 30min，冷却待用；
[0060] (6)精选思茅松成熟种子，用自来水冲洗lh，之后用30% H202浸泡30min，同时不 断摇动，然后用无菌水冲洗三次。放入灭菌的组培瓶中，每瓶放入5粒种子，置于23°C ±3°C 的环境中黑暗处培养，每天检查2次，剔除污染杂菌的种子，至种子萌发出白色芽点；
[0061] (7)按下列比例称取配制无菌苗培养基的各种组分：蛭石20kg，珍珠岩30kg，草炭 60kg，红壤土 150kg，牛粪 15kg，磷酸二氢铵 120g，MgS04130g，KH2P04120g ;将蛭石、珍珠岩、 草炭预湿，加入红壤土、牛粪，将磷酸二氢铵、MgS04、KH2P0 4加150ml水溶解，喷洒入基质中， 混匀，121 °C灭菌50min，冷却后将基质装入用高锰酸钾消毒的烧制陶土盆中；
[0062] (8)将萌发的思茅松种子移栽入烧制陶土盆中，置于温室大棚中，保持基质湿润， 在25°C ±3°C的温度下培养思茅松无菌苗；
[0063] (9)待思茅松无菌苗长出侧根时，在其根系接种12ml液体菌种，保持基质湿润，在 温度为25°C ±3°C的环境中培养3个月。
[0064] 实施例3的菌根感染率为85. 16 %。
[0065] 实施例4
[0066] (1)按下列比例称取配制母种培养基的各种组分：马钤薯160g，葡萄糖16g，酒石 酸铵2g，蛋白胨4g，MgS042g，KH2P042g，琼脂20g，水1200ml ;将各组分混合，调节pH至5. 5， 得到母种培养基，将母体培养基置于25mmX 200mm的试管中；
[0067] (2)采集野生中等成熟的硬皮马勃子实体，在超净工作台中无菌操作，用解剖刀切 取子实体中间部分2mmX 5mmX 10mm的组织块，将该组织块放入盛有母种培养基的试管中， 将试管置于27°C ±2°C的环境中，暗光培养，待菌丝体长满试管斜面，得到硬皮马勃母种； [0068] (3)按下列比例称取配制液体菌种培养基的各种组分：马钤薯160g，葡萄糖16g， 酒石酸铵2g，蛋白胨4g，MgS042g，KH2P042g，水1200ml ;将各组分混合，调节pH至5. 5,得到 液体菌种培养基，取300ml液体菌种培养基于500ml的三角瓶中，在121°C的温度下灭菌 30min，冷却待用；
[0069] (4)向三角瓶中加入硬皮马勃母种，加入量为1试管硬皮马勃母种加入10个三角 瓶中，将三角瓶置于27°C ±2°C的环境中，在150r/min下振荡暗光培养9天，得到液体菌 种，菌球浓度为1200个/ml ;
[0070] (5)在组培瓶底部平铺一层滤纸，用自来水浸湿，然后用包头纸系好，121°C灭菌 30min，冷却待用；
[0071] (6)精选云南松成熟种子，用自来水冲洗1.5h，之后用30% H202浸泡20min， 同时不断摇动，然后用无菌水冲洗三次。放入灭菌的组培瓶中，每瓶放入5粒种子，置于 23°C ±3°C的环境中黑暗处培养，每天检查2次，剔除污染杂菌的种子，至种子萌发出白色 芽点；
[0072] (7)按下列比例称取配制无菌苗培养基的各种组分：蛭石30kg，珍珠岩40kg，草炭 90kg，红壤土 250kg，牛粪 25kg，磷酸二氢铵 180g，MgS04180g，KH2P04180g ;将蛭石、珍珠岩、 草炭预湿，加入红壤土、牛粪，将磷酸二氢铵、MgS04、KH2P0 4加150ml水溶解，喷洒入基质中， 混匀，121 °C灭菌50min，冷却后将基质装入用高锰酸钾消毒的塑料盆中；
[0073] (8)将萌发的思茅松种子移栽入塑料盆中，置于温室大棚中，保持基质湿润，在 25 °C ±3 °C的温度下培养思茅松无菌苗；
[0074] (9)待思茅松无菌苗长出侧根时，在其根系接种18ml液体菌种，保持基质湿润，在 温度为25°C ±3°C的环境中培养3个月。
[0075] 实施例4的菌根感染率为85. 25 %。
[0076] 实施例5
[0077] (1)按下列比例称取配制母种培养基的各种组分：马钤薯150g，葡萄糖15g，酒石 酸铵1. 5g，蛋白胨3g，MgS04l. 5g，KH2P041. 5g，琼脂18g，水1000ml ;将各组分混合，调节pH 至5. 0,得到母种培养基，将母体培养基置于25mmX 200mm的试管中；
[0078] (2)采集野生中等成熟的硬皮马勃子实体，在超净工作台中无菌操作，用解剖刀切 取子实体中间部分2mmX 5mmX 10mm的组织块，将该组织块放入盛有母种培养基的试管中， 将试管置于27°C ±2°C的环境中，暗光培养，待菌丝体长满试管斜面，得到硬皮马勃母种；
[0079] (3)按下列比例称取配制液体菌种培养基的各种组分：马钤薯150g，葡萄糖15g， 酒石酸铵1. 5g，蛋白胨3g，MgS04l. 5g，KH2P041. 5g，水1000ml ;将各组分混合，调节pH至 5. 0,得到液体菌种培养基，取300ml液体菌种培养基于500ml的三角瓶中，在121 °C的温度 下灭菌30min，冷却待用；
[0080] (4)向三角瓶中加入硬皮马勃母种，加入量为1试管硬皮马勃母种加入10个三角 瓶中，将三角瓶置于27°C ±2°C的环境中，在145r/min下振荡暗光培养10天，得到液体菌 种，菌球浓度为2000个/ml ;
[0081] (5)在组培瓶底部平铺一层滤纸，用自来水浸湿，然后用包头纸系好，121°C灭菌 30min，冷却待用；
[0082] (6)精选思茅松成熟种子，用自来水冲洗1.5h，之后用30% H202浸泡20min， 同时不断摇动，然后用无菌水冲洗三次。放入灭菌的组培瓶中，每瓶放入5粒种子，置于 23°C ±3°C的环境中黑暗处培养，每天检查2次，剔除污染杂菌的种子，至种子萌发出白色 芽点；
[0083] (7)按下列比例称取配制无菌苗培养基的各种组分：蛭石24kg，珍珠岩35kg，草炭 75kg，红壤土 200kg，牛粪 20kg，磷酸二氢铵 150g，MgS04150g，KH2P04150g ;将蛭石、珍珠岩、 草炭预湿，加入红壤土、牛粪，将磷酸二氢铵、MgS04、KH2P0 4加150ml水溶解，喷洒入基质中， 混匀，121 °C灭菌50min，冷却后将基质装入用高锰酸钾消毒的塑料盆中；
[0084] (8)将萌发的思茅松种子移栽入塑料盆中，置于温室大棚中，保持基质湿润，在 25 °C ±3 °C的温度下培养思茅松无菌苗；
[0085] (9)待思茅松无菌苗长出侧根时，在其根系接种18ml液体菌种，保持基质湿润，在 温度为25°C ±3°C的环境中培养3个月。
[0086] 实施例5的菌根感染率为85. 67 %。
[0087] 实施例6
[0088] (1)采集野生硬皮马勃菌成熟子实体，切开包被露出孢子粉，孢子粉黑褐色、分散 方为成熟，将孢子粉连同包被风干，保存于7°C ±3°C冰箱待用。
[0089] (2)取步骤（1)中的孢子粉500g，加入无菌水500ml，均匀摇动，配成孢子悬浮液， 显微镜下镜检孢子浓度为5X 101°个/ml。
[0090] (3)培养无菌苗：无菌苗的培养过程与实施例1的步骤（5)-(8)完全相同。待无 菌苗长出侧根时，在其根系接种5ml孢子悬浮液，保持基质湿润，在温度为25°C ±3°C的环 境中培养3个月。
[0091] 实施例6的菌根感染率为85. 46 %。
[0092] 实施例7
[0093] (1)采集野生硬皮马勃菌成熟子实体，切开包被露出孢子粉，孢子粉黑褐色、分散 方为成熟，将孢子粉连同包被风干，保存于7°C ±3°C冰箱待用。
[0094] (2)取步骤（1)中的孢子粉300g，加入3000ml无菌水，均匀摇动，配成孢子悬浮 液，显微镜下镜检孢子浓度为5X 108个/ml。
[0095] (3)培养无菌苗：无菌苗的培养过程与实施例2的步骤（5)-(8)完全相同。待无 菌苗长出侧根时，在其根系接种7. 5ml孢子悬浮液，保持基质湿润，在温度为25°C ±3°C的 环境中培养3个月。
[0096] 实施例7的菌根感染率为87. 78 %。
[0097] 实施例8
[0098] (1)采集野生硬皮马勃菌成熟子实体，切开包被露出孢子粉，孢子粉黑褐色、分散 方为成熟，将孢子粉连同包被风干，保存于7°C ±3°C冰箱待用。
[0099] (2)取步骤⑴中的孢子粉50g，加入5000ml无菌水，均匀摇动，配成孢子悬浮液， 显微镜下镜检孢子浓度为5X 106个/ml。
[0100] (3)培养无菌苗：无菌苗的培养过程与实施例4的步骤（5)-(8)完全相同。待无 菌苗长出侧根时，在其根系接种l〇ml孢子悬浮液，保持基质湿润，在温度为25°C ±3°C的环 境中培养3个月。
[0101] 实施例8的菌根感染率为89. 88%。
[0102] 本发明所提供的合成方法可以有效建立硬皮马勃菌种与宿主树的共生关系，菌根 感染率高达85 % -90%。
[0103] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种硬皮马勃菌根苗的合成方法，其特征在于，包括下列步骤： (1) 将含有硬皮马勃子实体的组织置于母种培养基中培养，得到硬皮马勃母种，将硬皮 马勃母种接种到液体菌种培养基中，培养得到硬皮马勃液体菌种； 和/或， 将硬皮马勃孢子粉配制成硬皮马勃孢子悬浮液； (2) 将思茅松、云南松或高山松的种子培养至萌发出白色芽点移栽入无菌苗培养基中 培养得到无菌苗； (3) 待无菌苗长出侧根时，在其根系接种硬皮马勃液体菌种或硬皮马勃孢子悬浮液，保 持基质湿润，维持温度为25°C ±3°C，培养得到硬皮马勃菌根苗。
2. 根据权利要求1所述的硬皮马勃菌根苗的合成方法，其特征在于，所述液体菌种培 养基包括下列组分，按重量份计： 马钤薯100-200份，葡萄糖10-20份，酒石酸铵1-2份，蛋白胨2-4份，MgS04l-2份， ΚΗ2Ρ041-2份，水500-1500份；优选地，马钤薯120-180份，葡萄糖12-18份，酒石酸铵1-2 份，蛋白胨 2-4 份，MgS04l-2 份，ΚΗ2Ρ041-2 份，水 800-1200 份； 所述母种培养基为在所述液体菌种培养基各组分及用量的基础上增加15-20份的琼 脂。
3. 根据权利要求1所述的硬皮马勃菌根苗的合成方法，其特征在于，所述无菌苗培养 基包括下列组分，按重量份计： 蛭石 15000-40000 份，珍珠岩 20000-50000 份，草炭 50000-100000 份，红壤土 100000-300000 份，腐殖质 10000-30000 份，磷酸二氢铵 100-200 份，MgS04100-200 份， KH2P04100-200 份；优选地，蛭石 20000-30000 份，珍珠岩 30000-40000 份，草炭 60000-90000 份，红壤土 150000-250000份，腐殖质15000-25000份，磷酸二氢铵120-180份， MgS04130-180份，KH 2P04120-180份；优选地，腐殖质包括牛粪。
4. 根据权利要求1所述的硬皮马勃菌根苗的合成方法，其特征在于，在步骤（1)中， 配制硬皮马勃孢子悬浮液的方法为：按重量份计，向50-500份硬皮马勃孢子粉中加入 500-5000份无菌水，得到硬皮马勃孢子悬浮液。
5. 根据权利要求4所述的硬皮马勃菌根苗的合成方法，其特征在于，在步骤（3)中， 每株无菌苗接种硬皮马勃孢子悬浮液5-10ml，所述硬皮马勃孢子悬浮液的菌球浓度为 5X10 6-5X1010 个/ml。
6. 根据权利要求1所述的硬皮马勃菌根苗的合成方法，其特征在于，在步骤（1)中，将 含有硬皮马勃子实体的组织置于母种培养基中后，在27°C ±2°C的温度下，暗光培养得到 硬皮马勃母种。
7. 根据权利要求1所述的硬皮马勃菌根苗的合成方法，其特征在于，在步骤（1)中， 将硬皮马勃母种接入液体菌种培养基中后保持基质湿润，维持温度为27°C ±2°C，在 125-160r/min的转速下振荡暗光培养8-12天。
8. 根据权利要求1所述的硬皮马勃菌根苗的合成方法，其特征在于，在步骤（3) 中，每株无菌苗接种硬皮马勃液体菌种10_20ml，所述硬皮马勃液体菌种的菌球浓度为 1000-2000 个 /ml。
9. 根据权利要求1所述的硬皮马勃菌根苗的合成方法，其特征在于，所述母种培养基 和所述液体菌种培养基的pH分别为4. 0-6. 0。
10.根据权利要求1所述的硬皮马勃菌根苗的合成方法，其特征在于，在步骤（1)中，在 向液体菌种培养基中接种硬皮马勃母种之前，对液体菌种培养基进行灭菌处理。
【文档编号】A01G1/04GK104145716SQ201410425245
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月26日 优先权日:2014年8月26日
【发明者】纪光燕, 杨君巧, 杨太茂, 郭细龙, 谢飞, 郭雪玲, 张文仙 申请人:景洪宏臻农业科技有限公司