一种新的包含多个耐药基因盒的整合子的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术及耐药细菌监测领域，涉及一种新发现的与非伤寒沙 门氏菌耐药性密切相关的整合子。
【背景技术】
[0002] 由沙门氏菌引起的感染疾病呈全球性分布，近年来发病率明显上升，多见于婴幼 儿。加之沙门氏菌可通过质粒介导而对多种抗生素耐药，已成为流行病学中一个值得重视 的问题。本病全年均可发病，但多发生于夏秋季，有起病急、潜伏期短、集体发病等流行特 征。病后免疫力不强，可反复感染。沙门氏菌特别是非伤寒沙门氏菌的耐药问题已成为影 响人类健康的一个非常重要因素。
[0003] 整合子（integron)是一种可以通过捕获的外源基因，并将其转化为功能基因的 DNA片段，定位于染色体、转座子或质粒上，并可在其间流动。主要见于革兰阴性菌，以I类 整合子的发现在革兰阴性菌中分布最广。I类整合子的基本结构由3部分组成，两端是高度 保守序列，分别称作5'保守端（5' -CS)和3'保守端（3' -CS)，5' -CS长约I. 4kb，3' -CS长 约2kb，5 ' -CS和3 ' 一 CS之间的区域称作可变区，可变区由一个或多个基因盒组成，基因盒 一般含抗菌药物耐药基因。整合子是一种可移动的基因元件，位于细菌的质粒或染色体上， 可携带多个抗菌药物耐药基因，并能引起耐药基因的高效、快速转移，造成同种或不同菌种 之间的扩散，从而表达对不同抗生素的多重耐药性。
[0004] 深入研宄沙门氏菌耐药机制特别对有关整合子的研宄，可加强对感染菌株的流行 病学的了解，有利于抗菌药物的合理使用和新抗生素药物的开发；同时，加强抗菌药物的合 理应用，可减少整合子发生、减少分子进化的外部诱导环境，延缓多药耐药菌株的发生。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种含有耐药基因盒的整合子，将其命名为Inl086,其序列如SEQ ID NO. 1所示。该整合子含有aacA4基因盒、基因盒、catB3基因盒、arr-3基因盒、 dfrA27基因盒和aadA16基因盒。上述整合子表达多种耐药基因，从而导致含有该整合子的 菌种对多种抗生素药物具有耐药性。这些抗生素包括：氨基糖苷类抗生素、β内酰胺类抗 生素、磺胺类抗生素、氯霉素类抗生素、大观霉素类抗生素以及利福平类抗生素。
[0006] 常见的氨基糖苷类抗生素包括：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡 星。
[0007] 常见的β内酰胺类抗生素包括：青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类，以及新发展的头 霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β-内酰胺类抗生素。
[0008] 常见的磺胺类抗生素包括：磺胺异恶唑（SIZ)、磺胺二甲嘧啶（SM2)、磺胺嘧啶 (SD)、磺胺甲恶唑（SMZ)、磺胺间甲氧嘧啶（SMM)、柳氮磺吡啶（SASP)、磺胺米隆（SML)、磺胺 嘧啶银、磺胺醋酰（SA)、以及复方新诺明（甲氧苄啶+磺胺甲恶唑）。
[0009] 常见的氯霉素类抗生素包括：氯霉素、琥珀酸氯霉素。
[0010] 常见的大观霉素类抗生素包括：大观霉素、观霉素、奇霉素。
[0011] 常见的利福平类抗生素包括：利福平、利福喷汀。
[0012] 本发明的整合子是通过以下方法获得的：
[0013] (1)在台州市立医院感染科科病人血液培养阳性的标本中分离出1株对头孢曲 松、阿米卡星、复方新诺明耐药的细菌。
[0014] (2)然后将分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法 (补充药敏纸片）进行细菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为非伤寒沙门氏菌将其命名为 Nsa292。同时，试验证实此菌株对多种抗生素有显著耐药性。
[0015] (3)将Nsa292菌株培养扩增，提取所述耐药菌株的质粒。
[0016] (4)将步骤（3)提取纯化后的质粒使用BamHI酶切，琼脂糖凝胶电泳分离得到一段 长度为6, 667bp的DNA片段，将该DNA片段以常规方法与pMD19-T载体连接，然后热激转化 法转入感受态细胞E. coli T0P10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序。
[0017] 本发明还提供了一种含有整合子Inl086序列的重组质粒。所述质粒包含整合子 Inl086序列。在本发明的具体的实施方案中，所述重组质粒由整合子Inl086序列和pET32a 载体重组而成，整合子插入位点在pET32a载体上BamHI酶切位点处。所述重组质粒使用的 空载体可以使用任何常见的质粒载体代替。所述重组质粒的方法也为本领域技术人员熟知 的常规方法。
[0018] 本发明还提供了一种含有整合子Inl086的接合菌株。为了研宄整合子的耐药性， 本发明利用细菌质粒转导实验来检测鉴定整合子Inl086的功能，将Nsa292菌株与E. coli J53 Azk(对叠氮化钠耐药）菌株共培养，通过含叠氮化钠（300mg/L)和阿米卡星（0. 06mg/ L)平板筛选接合子，将接合子做药敏试验，受体菌拥有供体菌的耐药性。其中，所用阿米卡 星可用下列药物代替：氨曲南、妥布霉素、丁胺卡拉、庆大霉素、头孢替坦、头孢唑林、头孢吡 肟、头孢他啶、头孢曲松、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦（舒普深）、复 方新诺明。
[0019] 本发明还提供了一种含有整合子Inl086的重组菌株。为进一步证实上述接合 菌株的抗性来源于Nsa292菌株中的整合子，本发明将该整合子Inl086克隆入pET32a载 体中，整合子插入位点在pET32a载体上BamHI酶切位点处。并将其转化入野生型E. coli JM109中，通过含有Amp的平板选阳性克隆（含有pET32a-整合子的细菌）。将阳性克隆做 药敏试验，结果显示Nsa292菌株中的整合子Inl086可以使重组E. coli JM109菌株对以下 药物耐药：氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、丁胺卡拉、庆大霉素、头孢替坦、头孢唑林、头孢吡 肟、头孢他啶、头孢曲松、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦（舒普深）、复 方新诺明、氯霉素、大观霉素。
[0020] 本发明的优点和有益效果：
[0021] (1)本发明首次发现了序列为SEQ ID NO. 1的包括多种耐药基因盒的整合子 Inl086,该整合子的核苷酸序列在现有技术中未见报道。
[0022] (2)本发明整合子序列的发现，为临床用药提供了一定的指导作用。有利于临床上 减少某些抗菌药物的使用，降低该类耐药基因盒水平转移的选择压力，防止耐药细菌的爆 发性流行。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明的整合子Inl086的结构示意图。
[0024] 具体的实施方式
[0025] 下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明， 并不意味着限制本发明的保护范围。
[0026] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人， 分子克隆：实验室手册（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所描 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0027] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028] 实施例1整合子Inl086的鉴定
[0029] l、Nsa292菌株的分离和鉴定
[0030] I. 1 材料
[0031] 细菌药敏卡：法国bioMerieux的AST-GN13。AST-GN13药敏种类有：阿米卡星、氨 苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢唑啉、头孢吡肟、头孢替